Bejla'e'†Dirección actual: OX11 0DE, Reino Unido, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Le complejo 1 u jooch sáasil u chúumukil reacción (RC-LH1) leti' le componente fotosintético núcleo ti' le bacterias fototróficas moradas. K introducimos ka'ap'éel ba'ax u microscopía crioelectrónica ti' le complejo RC-LH1 u Rhodopseudomonas palustris. Le ba'ax resolución 2.65-Å ti' le complejo RC-LH114-W consiste ti' 14 subunidad LH1 bucles rodeando RC, ku interrumpe tumen proteína W, ka' jo'op' u le complejo xma' proteína-W jach jaatsatako'ob composición RC rodeado tumen RC. K'alik 16 subunidad LH1 bucle. Le comparación le k'iino'oba' ba'ax ku ts'aik visión ti' le dinámica le quinona ti' le complejo RC-LH1, incluyendo cambios conformacionales ma' determinados ka'ache' ti' le unión quinona ti' le ts'ono'oto' RC QB, bey le tu'ux ku yaantal le lu'umo'oba' unión quinona auxiliar, ku yáantiko'ob máan ti' RC. Le ba'ax chen yaan ti' le proteína W ku jets'ik u k'a'alal le lazo LH1, bey u beetik jump'éel beel uti'al u séebtal u k'e'exel le quinona/quinolona.
Le energía ku ts'aik le fotosíntesis je'el u páajtal u sostener óol tuláakal le kuxtal way yóok'ol kaabe', yéetel yaan nuxi' potencial utia'al u biotecnología solar. Ka' jo'op' u promover le fotosíntesis global, le bacterias fototróficas moradas xan exhiben jejeláas modos energía yéetel Buka'aj u ba'al metabólica. Je'el u páajtal u Jech le fotosíntesis yéetel ch'íijil bey bacterias heterotróficas ti' le éek'joch'e'enil, je'el u páajtal u fijar nitrógeno yéetel dióxido carbono, producir hidrógeno, ka degradar compuestos aromáticos (1-3). Utia'al u ts'aik energía ti' le k'iino'oba' procesos, le sáasilo' k'a'ana'an u jáan yéetel eficientemente sutk'esiko'ob ti' energía química. Le tuukula' ku káajal le ken u complejo antena u atrapa le sáasilo' ku chu'uchik le sáasilo' yéetel ku transfiere le energía atrapada ti' le chúumukil reacción (RC), bey u káajsik le separación kuuch (4 – 7). Le unidad básica ti' le fotosíntesis ti' le bacterias fototróficas moradas u compuesto tumen bin yano'ob 2 RC, rodeado tumen complejo cosecha sáasil 1 (LH1), formando le complejo núcleo RC-LH1. LH1 ku beeta'al tumen jump'éel tsol heterodímeros αβ curvos, jujuntúulal ti' le ku une ka'ap'éel moléculas clorofila bacteriana (BChl) jump'éel yéetel juntúul wa ka'ap'éel carotenoides (8-12). Le antena LH1 asab simple consiste ti' 16 wa 17 αβ heterodímeros rodeando RC (9-13) ti' jump'éel bucle cerrado, ba'ale' ti' uláak' complejos núcleo, péptidos transmembrana interrumpen le continuidad le LH1 circundante , Beyo' promoviendo le difusión quinol leti' quinona ichil RC yéetel citocromo bc complejo (1111, 13). Le páak'alo' fototrófica morado Rhodopseudomonas (Rps.) leti' jump'éel organismo modelo u páajtal u entender le energía yéetel le transferencia electrones ku yáanta'al le fotosíntesis. Le yáax ba'ax cristalina ti' Rps. U bixil le complejo palustris RC-LH1 jach RC, rodeado tumen 15 bucles LH1 heterodiméricos, ku interrumpen tumen juntúul proteína desconocida llamada "Proteína W" (14). Le proteína-W bin identificada posteriormente bey RPA4402, ba'ax le jump'éel proteína 10.5kDa ma' caracterizada yéetel óoxp'éel hélices transmembrana predichas (TMH) (16). K proponemos k'ex u k'aaba' le gen rpa4402 ku codifica proteína W ti' pufW utia'al u consistente yéetel le nomenclatura utilizada utia'al u genes codifican RC-L, M (pufL, pufM) yéetel LH1α, β (pufA, pufB) subunidades. Jach jats'uts, le proteína-W chéen yaan ti' yan 10% ti' RC-LH1, ku ye'esik Rps. palustris ku beetik ka'ap'éel jejeláas complejos RC-LH1. Te'ela', k informar le ba'ax crio-EM (cryo-EM) u ka'anal resolución u ka'ap'éel complejos núcleo, juntúule' yéetel proteína W yéetel 14 heterodímeros αβ, le uláak' xma' proteína W yéetel juntúul bucle cerrado 16 Heterodímero LH1. K ba'ax ku chíikbesik jump'éel k'eexpajal paso ti' le comprensión le complejo RC-LH1 ti' Rps. palustris, tuméen ts'o'ok k analizado le jo'olkaajo' homogénea ti' Amal variante yéetel yaan suficiente resolución utia'al u asignar chika'an Amal péptido yéetel pigmentos unidos yéetel lípidos yéetel quinonas relacionadas. Le comparación le k'iino'oba' ba'ax ku ye'esik u le óoxp'éel proteínas TMH-W ma' u séen Kaxa'antbil ti' je'el uláak' complejo RC-LH1 tak bejla'e' generan jump'éel beel quinona utia'al u acelerar le intercambio quinona leti' quinolona. U ts'o'ok identificado jump'éel meyaj ku u kúuchilo'ob u unión lípidos yéetel quinona conservados, ka ts'o'ok k revelado jump'éel túumben k'eexpajal conformacional ka' u combinación quinona yéetel RC, ku páajtal u adecuado utia'al u fotosistema II (PSII) RC u organismos fototróficos oxigenados. K hallazgos proporcionan túumben visión ti' le cinética u unión yéetel intercambio quinona leti' quinolona ti' le complejo núcleo RC-LH1 u bacterias fototróficas púrpuras.
Utia'al u facilitar jump'éel xook detallado ti' le ka'ap'éel complejos encontrados ti' Rps. palustris, k aislar Amal RC-LH1 tumen métodos bioquímicos. Le complejo proteína W-deficiente (ti' le futuro referido bey ΔpufW) bin purificado ti' le cepa carece ti' le gen pufW (16), ka chéen jump'éel complejo RC-LH1 je'el u páajtal u producido. Le complejo ku taasik proteína W ku beeta'al tumen juntúul cepa. Le proteína W ti' le cepa ku modifica yéetel juntúul etiqueta 10 x His ti' u C-terminal, utia'al u le complejo proteína W-contenido je'el u páajtal u combinado yéetel eficacia yéetel le proteína W asab carece tumen inmovilización metal. Le complejo jach eficazmente separado (16) Cromatografía u afinidad (IMAC).
Bix u ye'esik ti' le yoochel 1, le ka'ap'éel complejos ku taasik jump'éel RC óoxp'éel subunidades (RC-L, RC-M yéetel RC-H) rodeado tumen juntúul antena LH1. Le ba'ax 2.80-A ti' le complejo mina'an ti' proteína-W ye'esik 16 heterodímeros αβ, formando jump'éel bucle LH1 cerrado completamente rodeando RC, ti' le futuro referido bey le complejo RC-LH116. Le ba'ax 2.65Å ti' le complejo ku taasik proteína-W yaan ti' jump'éel 14-heterodímero LH1 interrumpido tumen proteína-W, ti' le k'iino'oba' referidos bey RC-LH114-W.
(A yéetel B) Representación superficial ti' le compuesto. (C yéetel D) Pigmentos unidos expresados ​​ti' varillas. (E yéetel F) Le complejos observados tak le superficie citoplasmática yaan ti' le péptidos yéetel subunidades LH1 representadas ti' caricaturas, ka ku numeran ti' le sentido le p'isibo' tak le brecha proteína-W [consistente yéetel le numeración Rba. sphaeroides complex (13)]. Utia'al LH1-α, u boonil le subunidad proteína jach k'an; uti'al LH1-β, u boonil le subunidad proteína jach azul; uti'al le proteína-W, le proteínao' chak; uti'al RC-H, leti' cian; uti'al RC-L, leti'e' naranja; uti'al RC-M, magenta. Le cofactores ku chíikbesa'al tumen varillas, ya'ax ku chíikbesik BChl yéetel BPh a moléculas, morado ku chíikbesik carotenoides, yéetel k'an ku chíikbesik moléculas UQ10. (G yéetel H) Visión ampliada ti' le brecha proteína-W ti' le región equivalente ti' le complejo RC-LH114-W (G) yéetel le complejo RC-LH116 (H). Le cofactores ku ye'esik ti' bix u llenado le kúuchil, le quinona quelada ku ye'esik ti' azul. Le brecha proteína-W ku resalta tumen juntúul internet ichil discontinua azul ti' (G), yéetel le mejen agujeros tu'ux quinona leti' quinolol difunde ti' le ts'ipit k'ab LH116 ku resaltan tumen juntúul internet ichil discontinua negra ti' (H).
U yoochel 1 (A yéetel B) ku ye'esik le RC rodeado tumen matrices abiertas wa cerradas u heterodímeros LH1αβ, jujuntúulal ti' le ku une ka'ap'éel BChl yéetel juntúul carotenoide (yoochel 1, C yéetel D). Xook ts'o'ok u beeta'al ts'o'ok u ye'esik Rps leti' le complejo LH1. Ti' le bejo' biosintético ti' le xantina espirulina, le k'iino'oba' especies ku taasik poblaciones mixtas u carotenoides (17). Ba'ale', le spiropirroxantina jach le carotenoide dominante yéetel u densidad jach satisfactoria. Le o'olale', k yéeyik u modelar le espiroxantina ti' tuláakal le kúuchilo'ob unión LH1. Le polipéptidos alfa yéetel beta ku TMHs k'áate' yéetel regiones exteriores u membrana Kóomtak (yoochel 1, jump'éel, B, E, yéetel F). Kex ma' bin u yila'al u densidad 17 residuos ti' le C-terminal, le polipéptido alfa bin hendido u Met1 u Ala46 ti' ka'ap'éel complejos. β polipéptido bin u reducido u Gly4 u Tyr52 ti' RC-LH116, yéetel u Ser5 u Tyr52 ti' RC-LH114-W. Ma' ila'ab mix jump'éel densidad 3 wa 4 N-terminal wa 13 C-terminal residuos (yoochel S1). Análisis u espectrometría u juuch' le complejo mixto RC-LH1 preparado ti' le cepa bin yano'ob salvaje tu ye'esaj u le región sa'atal bin u resultado le escisión heteróloga ti' le k'iino'oba' péptidos (yoochel S1 yéetel S2). Le formilación N-terminal ti' α-Met1 xan bin u observada (f). Le análisis tu ye'esaj u le α-péptido consiste ti' residuos fMet1 u Asp42 leti' Ala46 leti' Ala47 leti' Ala50, yéetel le β-péptido consiste ti' residuos Ser2 u Ala53, ba'ax táan ti' ma'alo'ob éejenil yéetel le mapa densidad EM baja temperatura.
U nupikubáa α-His29 yéetel β-His36 ku beetik u BChls cara in cara; Amal heterodímero αβ ku much'ik yéetel u láak'o'ob uti'al u beetik jump'éel bucle abierto (RC-LH114-W) wa jump'éel bucle cerrado (RC-LH116) mentik kex le RC Le matriz pigmento acoplado yéetel excitón (yoochel 1, C yéetel D). Ti' comparación yéetel le banda 877 nm ti' RC-LH114-W, le 880 nm absorción rojo desplazamiento ti' RC-LH116 jach 3 nm (yoochel 2A). Ba'ale', le espectro dicroísmo circular óol le k'iino' je'el xano' (yoochel 2B), indicando u kex yaan jump'éel jela'anil in chika'an ichil le bucles abiertos yéetel cerrados, le entorno local ti' BChls jach similar. Le redshift absorción je'el u páajtal u resultado le movimiento térmico reducido yéetel aumento le estabilidad ti' le lazo cerrado (18, 19), le k'eexpajal ti' le acoplamiento pigmento causado tumen le lazo cerrado (20, 21), wa jump'éel combinación le k'iino'oba' ka'ap'éel táanil (11).
(A) Espectro u absorción ultravioleta leti' visible leti' naats' infrarrojo, le picos ku marcados yéetel u pigmentos correspondientes yéetel normalizados ti' le pico BPh ti' 775 nm. (B) Espectro dicroísmo circular normalizado u absorción BChl ti' 805 nm. (C yéetel D) Espectros ΔA seleccionados ti' le espectros absorción resueltos tumen k'iin ti' le complejo RC-LH114-W (C) yéetel le complejo RC-LH116 (D). Utia'al u ma'alo'ob comparación, tuláakal le espectros ku normalizan u ∆A ti' −A ti' 0.2 ps. (E) Le tasa u oxidación le citocromo c2 ka' u irradiación tu taan jejeláas concentraciones UQ2 (wil wíimbala' S8 utia'al u datos crudos). (F) Ti' le células cultivadas yáanal sáasil baja, mediana wa ka'anal intensidad (10, 30 wa 300μMm-2 s-1, respectivamente), le proteína W yéetel RC-L subunidades ti' le complejo purificado yéetel le relación membrana separada. Determinar le nivel proteína tumen electroforesis ti' gel SDS-poliacrilamida yéetel inmunoensayo (wil wíimbala' S9 utia'al u datos crudos). Ilawil le relación relativa ti' le complejo RC-LH114-W purificado. Le relación estequiométrica ti' RC-L ti' proteína-W ti' le complejo jach 1:1.
Le BChls ti' le posición 1 ti' le bucle αβ14 deformado ti' RC-LH114-W (yoochel 1, jump'éel, C, yéetel E) ku asab naats'il ti' le donante primario RC (P) tumen 6.8Å u le BChls equivalentes ti' RC-LH116 (yoochel. 1, B, D, yéetel F, yéetel S3); kex beyo', le cinética absorción transitoria ti' le ka'ap'éel complejos muestran u utia'al RC-LH114-W yéetel RC-LH116, le constantes k'iin transferencia energía excitación u LH1 u RC le 40 ± 4 yéetel 44 ± 3 ps (yoochel 2). , C yéetel D, Figura S4 yéetel Tabla S2). Xan mina'an mix jump'éel jela'anil in significativa ti' le transferencia electrónica ichil RC (yoochel S5 yéetel analte'o' suplementario relacionado). K sospechamos u le estrecha correspondencia le k'iin transferencia energía ichil LH1 yéetel RC-P jach debido a le similar distancia, ángulo yéetel energía potencial u óol tuláakal le máasewáalo'obo' u BChl ti' le ka'ap'éel bucles LH1. Ku yila'al u xak'altik le patrón energía LH1 uti'al u k'uchul le distancia mínima ma' asab séeba'an u transferencia energía directa u kúuchilo'ob subóptimas u RC. Le bucle LH1 u bucle abierto ti' RC-LH114-W xan je'el u páajtal u máan tumen movimiento térmico insignificante yáanal condiciones baja temperatura utia'al u análisis estructural, ka yaan jump'éel conformación ts'ipit k'ab αβ14 asab chowak u temperatura ambiente tak le distancia pigmentación βBChls ti' le posición RC 1.
Le complejo RC-LH116 ku taasik 32 BChls yéetel 16 carotenoides, yéetel u arreglo global le le k'iino' je'el xano' u le obtenido ti' Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) DB0 (PDB) cepa (IDC 297) (297)) yéetel algas ya'ax (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Ka' ts'o'ok u alinear, chéen mejen desviaciones ti' le posiciones heterodímeros αβ bino'ob observadas, especialmente 1-5, 15, yéetel 16 (yoochel S6). U yaantal le proteína-W yaan jump'éel impacto significativo ti' le ba'ax LH1. U óoxp'éel TMHs táan conectados tumen bucles Kóomtak, yéetel le N-terminal ti' le tséel lúmen ti' le complejo yéetel le C-terminal ti' le tséel citoplasmático (Figuras 1A yéetel 3, A u D). Proteína-W jach tu gran medida hidrófoba (yoochel 3B), ka TMH2 yéetel TMH3 interactúan yéetel LH1αβ-14 utia'al u formar jump'éel superficie transmembrana (yoochel 3, B yéetel E u G). Le interfaz ku beeta'al chuunil laat'a'an tumen residuos Phe, Leu yéetel Val ti' le región transmembrana. Le k'iino'oba' residuos ku apilados yéetel aminoácidos hidrófobos yéetel pigmentos αβ-14. Yaan residuos polares xan contribuyen ti' le interacción, incluyendo le enlace hidrógeno ichil W-Thr68 yéetel β-Trp42 ti' le superficie le cavidad compleja (yoochel 3, F yéetel G). Tu yóok'ol le citoplasmao', Gln34 yaan tu tséel le múuch' keto ti' carotenoides αβ-14. Beyxan, le molécula n-dodecil β-d-maltoside (β-DDM) bin resuelta, ka u nej hidrófoba extendió ti' le interfaz ichil proteína-W yéetel αβ-14, ka u nej lípidos je'el u páajtal u Kula'an ti' u wíinkilal. Xan k notamos u le regiones resolución C-terminal ti' le proteína W yéetel RCH táan jach náats'al, ba'ale' ma' ichil le alcance formación interacciones específicas (yoochel 1, jump'éel yéetel E). Ba'ale', je'el u páajtal u yaantal interacciones ti' le aminoácidos C-terminales ma' resueltos ti' le k'iino'oba' ka'ap'éel proteínas, ku páajtal ts'aik jump'éel mecanismo utia'al u reclutamiento le proteína-W ichil le montaje le complejo RC-LH114-W.
(A) Proteína-W, ku enfrenta ti' le interfaz yéetel LH1αβ14 ti' bix u historieta, yaan jump'éel tsolokbal lateral ti' bix u varilla (rojo), ku ye'esik ti' jump'éel nu'ukulil le diagrama potencial electrostático (superficie gris transparente yéetel juntúul nivel contorno 0.13). (B) Proteína-W representada tumen juntúul superficie boonil hidrófoba. Le kúuchilo'ob polares yéetel cargadas ku chíikpajal ti' cian, le kúuchilo'ob hidrófobas ku chíikpajal ti' sak, yéetel le kúuchilo'ob fuertemente hidrófobas ku chíikpajal ti' naranja. (C yéetel D) Proteína-W ku chíikpajal ti' le historieta, u orientación le k'iino' je'el xano' bey ti' (A) (C), ka girado tumen 180 ° (D). Bin u kúuchil ti' le secuencia, le residuos distinguibles adoptan jump'éel esquema u boonil arco iris, tu'ux le N-terminal jach azul yéetel le C-terminal jach rojo. (E) Proteína-W ti' le bak'paach vista bey ti' (A), yéetel le residuos ti' le interfaz proteína-W:LH1 ku representan tumen varillas yéetel marcas adjuntas. (F) Proteína-W ku gira 90° relativo ti' (E) yéetel LH1αβ14 ti' le representación boonolo'obo, yéetel relativo ti' le residuos interfaz ti' le representación barra. Le residuos sobresalientes ti' le polipéptido beta ku etiquetan. Le cofactor ku ye'esik bey jump'éel barra ku coincidir yéetel u boonil le yoochel 1, le β-DDM descompuesto ku ye'esik ti' gris, yéetel le oxígeno ku ye'esik ti' rojo. (G) Le yila'al ti' (F) ku sutk'esiko'ob 180°, yéetel le residuos prominentes ti' le polipéptido alfa etiquetado.
Proteína-W ku k'exik jump'éel heterodímero αβ (le 15 ti' le yoochel 1F), tune' ku jets'ik u k'áalal le lazo yéetel u inclinar le yáax óoxp'éel heterodímeros αβ. Ku yila'al u le ángulo inclinación máximo ti' le yáax heterodímero αβ-1 relativo ti' le cha'ano' normal bin 25 ° u 29 ° (yoochel 1, jump'éel yéetel E), ku bin formado tumen le 2 ° u 8 ° inclinación αβ-1 ti' RC jump'éel contraste agudo-LH116 (yoochel 1, B yéetel F). Le segunda yéetel tercera heterodímeros ku inclinados ti' 12° u 22° yéetel 5° u 10°, respectivamente. Tuméen le obstáculo estérico ti' RC, le inclinación ti' αβ-1 ma' analte'obo' yaan le segunda par ti' αβ (ku corresponde ti' le 16 αβ ti' le yoochel 1F), formando bey jump'éel brecha clara ti' le ts'ipit k'ab LH1 (yoochel 1, jump'éel yéetel E) . Tuméen mina'an ka'ap'éel heterodímeros αβ, acompañados tumen le asab kantúul BChl yéetel ka'ap'éel carotenoides, mix juntúul ti' le carotenoides ku unen ti' le subunidad αβ-1 torcida, ts'áaik tumen resultado jump'éel ts'ipit k'ab LH114-W ku taasik 13 carotenoides Vegetarian yéetel 28 BChls. Le estimaciones resolución locales ti' le ka'ap'éel complejos ti' le αβ1 u 7 regiones ku menores u le u yala'ab le lazo LH1, ku páajtal reflejar le plasticidad inherente ti' le subunidad LH1 adyacente ti' le ts'ono'oto' RC QB (yoochel 4) .
Le oochelo'ob RC-LH114-W (A yéetel B) yéetel RC-LH116 (C yéetel D) ku ye'esik tak le bak'paach vista superior leti' vista lateral (A yéetel B) (A yéetel C) yéetel superficie le cavidad ti' le Fig. 1. (B yéetel D). Le teclas boonilo'obo' ku chíikpajal tu x-no'oj.
Le chen uláak' complejo núcleo característico yéetel juntúul relación estequiométrica u 1:14 leti' le dímero Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Ba'ale', le proteína W yéetel PufX mina'an ti'ob mix jump'éel homología obvia, yéetel yaan jump'éel impacto significativo ti' u respectivas ba'ax LH1. PufX leti' jump'éel chéen TMH yéetel jump'éel dominio citoplasmático N-terminal ku interactúa yéetel le tséel citoplasmático ti' le subunidad RC-H (13) ti' jump'éel posición correspondiente u Rps. palustris LH116αβ-16. PufX ku beetik jump'éel beel uti'al u k'e'exel quinona/quinolona ichil RC-LH1 yéetel le complejo citocromo bcl yéetel yaan ti' tuláakal Rba. sphaeroides core complex (13). Kex le interfaz monómero-monómero yaan ti' Rba. Le dímero sphaeroides RC-LH1-PufX Kula'an ti' le posición unión ti' le proteína W ti' RC-LH114-W, yéetel le brecha inducida tumen PufX yéetel proteína-W yaan ti' jump'éel posición equivalente (Figura S7A). Le brecha ti' RC-LH114-W xan u alinea yéetel le beel quinona hipotético (8) u Pseudomonas rosea LH1, ku táan formado tumen péptidos ma' relacionados yéetel le proteína W wa PufX (Figura S7B). Beyxan, le beel quinona ti' Blc. Le LH1 ya'ax esmeralda formado tumen exclusión jump'éel subunidad γ (7) Kula'an ti' jump'éel posición similar (yoochel S7C). Kex tumen jejeláas proteínas, u chíikpajal le k'iino'oba' canales quinona leti' quinolol ti' jump'éel posición común ti' le complejo RC-LH1 bey u jump'éel ejemplo evolución convergente, indicando u le brecha creada tumen le proteína W je'el actuar bey juntúul beel quinona.
Le brecha ti' le bucle LH114-W ku cha'antik le formación jump'éel región membrana continua ichil le kúuchil interno ti' le complejo RC-LH114-W yéetel le membrana u granel (yoochel 1G), kúuchil conectar le ka'ap'éel dominios yo'osal jump'éel poro proteína bey ti' le proteínas. Le complejo RC-LH116 bey jump'éel Tch cerrado. Complejo bey aguja (22) (yoochel 1H). Tuméen le difusión quinona tumen le membrana jach asab séeba'an u le difusión tumen le beel proteína estrecha, le lazo LH114-W abierto je'el u páajtal u permitir asab séeba'an rotación RC u le lazo LH116 cerrado, ka le difusión quinona ti' le RC je'el u páajtal u asab restringida. Utia'al u probar wa le proteína W afecta u yokol k'ujo'ob ti' quinonas yo'osal RC, realizamos jump'éel ensayo oxidación citocromo ti' jump'éel cierta concentración ubiquinona 2 (UQ2) (jump'éel análogo u UQ10 ku yúuchul yéetel juntúul quijada isopreno asab kóom) (yoochel 2E). Kex u yaantal le quinona quelada obstaculiza le determinación exacta ti' le constante Michaelis aparente (RC-LH114-W yéetel RC-LH116 ku adecuados utia'al u 0.2±0.1μM yéetel 0.5±0.2μM, respectivamente), le tasa máxima u RC-LH114-W ( 4.6±0.6±0.2μM) jach s-1 28±5% asab nojoch ti' RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Tu káajbale' k tukultaj u proteína-W yaan ti' yan 10% ti' le complejo núcleo (16); waye', le tasas ocupación ti' le células tuméen yáanal sáasil, chúumuk sáasil yéetel ka'anal sáasil ku 15±0.6%, 11±1% yéetel 0.9±0.5, respectivamente % (Figura 2F). Le comparación cuantitativa ti' le espectrometría ti' masas tu ye'esaj u le adición etiqueta histidina ma' xu'ulsiko'ob le abundancia relativa ti' proteína-W ti' comparación yéetel cepas bin yano'ob salvaje (P = 0.59), yo'olal le k'iino'oba' niveles ma' le jump'éel artefacto proteína-W modificada (yoochel S10). Ba'ale', le baja ocupación proteína-W ti' le complejo RC-LH1 je'el u páajtal u permitir u yaan RCs voltear ti' jump'éel tasa acelerada, mitigando bey le intercambio quinona leti' quinolona asab lento ti' le complejo RC-LH116. K ts'áaj k yilaje' u le ka'anal tasa ocupación sáasil ma' táan consistente yéetel le datos transcriptómicos recientes, ku indica u expresión le gen pufW aumenta yáanal sáasil k'a'am (Figura S11) (23). U jela'anil ichil le transcripción pufW yéetel le incorporación proteína-W ti' le complejo RC-LH1 jach confusa yéetel je'el reflejar le regulación compleja ti' le proteína.
Ti' RC-LH114-W, 6 cardiolipina (CDL), 7 fosfatidilcolina (POPC), 1 fosfatidilglicerol (POPG) yéetel 29 moléculas β-DDM ku asignan yéetel ku modelan ti' leti' 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs yéetel 21βDs. RC-LH116 (Yoochel 5, A yéetel B). Ti' le ka'ap'éel ba'alo'oba', CDL óol Kula'an ti' le tséel citoplasmático ti' le complejo, ka' jo'op' u POPC, POPG yéetel β-DDM Kula'an tu su mayoría ti' le tséel luminal. Ka'atúul moléculas lípidos yéetel detergente bino'ob aisladas ti' le región αβ-1 u αβ-6 ti' le complejo RC-LH114-W (yoochel 5A), ka jo'op'éel bino'ob aisladas ti' le región equivalente ti' RC-LH116 (yoochel 5B). Ya'ab lípidos bino'ob encontrados ti' le uláak' tséel le complejo, chuunil laat'a'an CDL, acumulados ichil RC yéetel αβ-7 u αβ-13 (yoochel 5, jump'éel yéetel B). Uláak' lípidos yéetel detergentes estructuralmente resueltos Kula'an paach le ts'ipit k'ab LH1, ka cadenas acil ma'alob resueltas ku extienden ichil subunidades LH1, tentativamente designadas bey β-DDM ti' RC-LH114-W, ka definidas bey β-DDM ti' RC jump'éel mezcla β-DDM yéetel PO-LH116-LH16. Le posiciones similares ti' le lípidos quelantes yéetel detergentes ti' k ba'ax indican u le lu'umo'oba' unión fisiológicamente relevantes (yoochel S12A). U kúuchil le moléculas equivalentes ti' Tch xan yaan ma'alo'ob consistencia. O'olkij yéetel Trv. Le cepa 970 RC-LH1s (yoochel S12, B tak E) (9, 12) yéetel le residuos unión hidrógeno ti' le múuch' pool lípidos mostraron bastante ma'alo'ob conservación ti' le alineación secuencia (yoochel S13), indicando u CDL conservado ku une ti' RC (24), le k'iino'oba' lu'umo'oba' páajtal u conservados ti' le complejo RCH-LH1.
(A yéetel B) RC-LH114-W (A) yéetel RC-LH116 (B) péptidos ku representan tumen caricaturas, yéetel le pigmentos ku representan tumen varillas, utilizando le esquema u boonil ti' le yoochel 1. Le lípidos ku muestran ti' rojo, yéetel le detergentes ku muestran ti' gris. UQ unido ti' RC QA yéetel QB lu'umo'oba' jach k'an, ka' jo'op' u UQ aislado jach azul. (C yéetel D) Le bak'paach vistas bey (A) yéetel (B), yéetel lípidos omitidos. (E u G) Visión ampliada ti' Q1 (E), Q2 (F) yéetel Q3 (G) u RC-LH116, yéetel cadenas laterales ku influyen ichil yan. Le enlaces hidrógeno ku ye'esik bey líneas discontinuas negras.
Ti' RC-LH116, RC QA yéetel QB UQ, ku táakpajalo'ob ti' le transferencia electrones ti' le tuukula' separación kuuch, ku descomponen ti' u kúuchilo'ob unión. Ba'ale', ti' RC-LH114-W, QB quinona ma' u resuelto yéetel yaan u discutido ti' detalle in continuación. Beyxan ti' kaambalilo'ob quinonas QA yéetel QB, ka'ap'éel moléculas UQ queladas (Kula'an ichil le anillos RC yéetel LH1) ku asignan ti' le ba'ax RC-LH114-W bin u múuch' pool ma'alob resueltos (Kula'an ti' Q1 yéetel Q2, respectivamente). kúuchil). Figura 5C). Ka'ap'éel kúuchilo'ob isopreno ku ts'a'abal ti' Q1, yéetel le mapa densidad ku resuelve le 10 colas isopreno completas ti' Q2. Ti' le ba'ax RC-LH116, óoxp'éel moléculas UQ10 queladas (Q1 u Q3, yoochel 5D) bino'ob resueltas, ka tuláakal le moléculas yaan jump'éel densidad clara ti' tuláakal u nej (yoochel 5, D u G). Ti' le ka'ap'éel ba'ax, le posiciones le múuch' pool quinona Q1 yéetel Q2 yaan excelente consistencia (Figura S12F), ka chéen interactúan yéetel RC. Q1 Kula'an tu jool le brecha W ti' RC-LH114-W (yoochel 1G yéetel 5, C, D yéetel E), yéetel Q2 Kula'an naats' le ts'ono'oto' unión QB (yoochel 5, C, D) yéetel F). Le residuos L-Trp143 yéetel L-Trp269 conservados táan jach naats'il ti' Q1 yéetel Q2 yéetel proporcionan interacciones π-apilamiento potenciales (yoochel 5, E yéetel F, yéetel yoochel S12). L-Gln88, 3.0 Å ti' le oxígeno distal ti' Q1, proporciona jump'éel k'a'am enlace hidrógeno (yoochel 5E); le residuoa' ku kanáanta'al ti' tuláakal le RCs excepto le relación asab náach (yoochel S13). L-Ser91 jach conservadoramente sustituido tumen Thr ti' óol tuláakal le máasewáalo'obo' u uláak' RCs (yoochel S13), jach 3.8 Angstroms ti' le oxígeno metílico u Q1, ka je'el u páajtal u ts'aik enlaces hidrógeno débiles (yoochel 5E). Q3 ma' chíikpajal yaan jump'éel interacción específica, ba'ale' Kula'an ti' le región hidrófoba ichil le subunidad RC-M yéetel le subunidad LH1-α 5 u 6 (yoochel 5, D yéetel G). Q1, Q2 yéetel Q3 wa quinonas queladas naats'il xan u séen resuelto ti' Tch. O'olkij, Trv. Cepa 970 yéetel Blc. Le ba'ax iris (9, 10, 12) señala jump'éel ts'ono'oto' unión quinona auxiliar conservado ti' le complejo RC-LH1 (Figura S12G). Le jo'op'éel UQs descompuestos ti' RC-LH116 táan ti' ma'alo'ob éejenil yéetel le 5.8±0.7 ti' Amal complejo determinado tumen cromatografía líquida u ka'anal rendimiento (HPLC), ka' jo'op' u le óoxp'éel UQs descompuestos ti' RC-LH114-W ku menores u Le je'o' medido ti' 6.2±0.3 (Fig. S14) indica u yaan le moléculas ma' resuelven tsoolil.
Le polipéptidos L yéetel M pseudo-simétricos ku taasik jo'op'éel TMHs yéetel ku beetiko'ob jump'éel heterodímero ku nupik jump'éel dímero BChl, ka'ap'éel monómeros BChl, ka'ap'éel monómeros bacteriófagos (BPh), yéetel juntúul hierro ma' Heme yéetel juntúul wa ka'ap'éel moléculas UQ10. Yo'osal u yaantal enlaces hidrógeno ti' le múuch' cetona terminal yéetel u k'ajóolta'an acumulación ti' Rps, le carotenoides ku incorporan ti' le M-subunidad, ku k'aaba' cis-3,4-dehydroorhodopin. Especie (25). Le dominio membrana exterior ti' RC-H táan anclado ti' le membrana tumen juntúul chéen TMH. Le ba'ax RC tuláakal jach similar ti' le óoxp'éel subunidades RC u especies relacionadas (bey Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Le macrociclos BChl yéetel BPh, le columna vertebral carotenoide yéetel hierro ma' heme ku superponen ichil le rango resolución le k'iino'oba' ba'ax, bey le múuch' pool UQ10 ti' le ts'ono'oto' QA yéetel le quinona QB ti' RC-LH116 (yoochel S15).
U yaantal ka'ap'éel ba'ax RC yéetel jejeláas tasas ocupación ts'ono'oto' QB proporciona jump'éel túumben oportunidad utia'al u examinar le cambios conformacionales consistentes ku acompañan le unión quinona QB. Ti' le complejo RC-LH116, le quinona QB Kula'an ti' le posición "proximal" jaatsatako'ob unida (26), ba'ale' le separación RC-LH114-W mina'an ti' le quinona QB. Mina'an quinona QB ti' RC-LH114-W, ba'ax jach sorprendente tuméen le complejo táan activo, asab u le complejo RC-LH116 yéetel quinona QB estructuralmente resuelta. Kex le ka'ap'éel anillos LH1 quelan yan seis quinonas, Kanp'éel ku resuelven estructuralmente ti' le ts'ipit k'ab RC-LH116 cerrado, ka' jo'op' u chéen óoxp'éel ku estructuralmente limitados ti' le ts'ipit k'ab RC-LH114-W abierto. Le aumento ti' le trastorno estructural je'el u páajtal u reflejar le reemplazo asab séeba'an u RC-LH114-W QB lu'umo'oba', asab séeba'an cinética quinona ti' le complejo, yéetel asab probabilidad u cruzar le lazo LH1. K sugerimos u le si'ipil UQ ti' le ts'ono'oto' RC QB u RC-LH114-W je'el u páajtal u le resultado jump'éel complejo asab complejo yéetel asab activo, ka le ts'ono'oto' QB u RC-LH114-W ts'o'ok sido inmediatamente congelado ti' le volumen negocios UQ Le p'isibij específica (le joolnajo' le ts'ono'oto' QB ts'o'ok u cerrado) refleja le conformación ti' le atividad.
Wa mina'an QB, le rotación acompañante ti' L-Phe217 ti' jump'éel posición ma' compatible yéetel le unión UQ10, tuméen causará jump'éel colisión espacial yéetel le yáax unidad isopreno ti' u nej (yoochel 6A). Beyxan, le cambios conformacionales k'ajle' obvios ku obvios, especialmente le hélice de (hélice kóom ti' le lazo ichil TMH D yéetel E) tu'ux L-Phe217 ku desplaza ti' le pooj unión QB yéetel le rotación L-Tyr223 (Yo'osal 6A ) Utia'al u jaatik le enlace hidrógeno yéetel le marco M-Ap4 yéetel muts'ik in le entrada u unión QB ts'ono'oto' (yoochel 6B). Le hélice de pivota ti' u k'oja'ano'obo', le Cα ti' L-Ser209 ku desplaza tumen 0.33Å, ka' jo'op' u le L-Val221Cα ku desplaza tumen 3.52Å. Mina'an cambios observables ti' TMH D yéetel E, ku superimponibles ti' ambas ba'ax (yoochel 6A). Tak tu'ux k ojel, lela' le yáax ba'ax ti' le RC ku yúuchul ku k'alik le ts'ono'oto' QB. jump'éel comparación yéetel le ba'ax completa (QB-bound) ku ye'esik bey ma' u xu'ulul le quinona, k'a'abéet jump'éel k'eexpajal conformacional uti'al u yokol ti' le quinona. L-Phe217 ku sutk'esiko'ob uti'al u beetik jump'éel interacción π-stacking yéetel le múuch' pool quinona, yéetel le hélice ku péek tak paachil, ku cha'ik u le esqueleto L-Gly222 yéetel le tsolokbal lateral u L-Tyr223 utia'al u formar jump'éel páawo'ob enlace hidrógeno yéetel juntúul ba'ax enlace hidrógeno estable (yoochel 6, jump'éel yéetel C).
(A) Caricatura superpuesta ti' holograma (tsolokbal L, tsolokbal naranja leti' M, magenta) yéetel apo (gris) ba'ax, ti' le ku le residuos clave ku muestran ti' bix u representación bey varilla. UQ10 ku chíikpajal tumen jump'éel barra k'an. Le internet ichil punteada ku ye'esik le enlaces hidrógeno formados ti' tuláakal le ba'ax. (B yéetel C) Le representación superficial ti' le apolipoproteína yéetel le ba'ax ts'ipit k'ab entera, destacando le oxígeno tsolokbal lateral ti' L-Phe217 ti' azul yéetel L-Tyr223 ti' rojo, respectivamente. Le subunidad L jach naranja; le subunidades M yéetel H ma' u boonilo'ob. (D yéetel E) Apolipoproteína (D) yéetel tuláakal (E) RC QB kúuchilo'ob [boonil tumen (A) respectivamente] yéetel Thermophilus thermophilus PSII (ya'ax, azul yéetel quinona plástico; PDB ID: 3WU2) Alinear (58).
Ma' táan u páa'ta'al, kex yaan ya'abkach ba'ax u RCs deficientes ti' QB xma' LH1, le cambios conformacionales observados ti' le xooko' ma' u séen informado ka'ache'. Le je'elo'oba' incluyen le ba'ax u agotamiento QB u Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) yéetel Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), tuláakal le ku óol le k'iino' je'el xano' bey u ba'ax QB global. Le inspección cercana ti' 3PRC reveló u LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) moléculas detergente ku unen ti' le joolnajo' le posición QB, ku páajtal Jech u reorganización ti' jump'éel conformación cerrada. Kex LDAO ma' u descompone ti' le bak'paach posición ti' 1EYS wa 1OGV, le k'iino'oba' RCs ku preparan utilizando le k'iino' je'el xano' detergente yéetel tune' je'el u páajtal u producir le k'iino' je'el xano' efecto. Le ba'ax cristalina ti' Rba. Sphaeroides RC co-cristalizado yéetel citocromo c2 (PDB ID: 1L9B) xan bey u yaantal jump'éel ts'ono'oto' QB cerrado. Ba'ale', tu este caso, le región N-terminal ti' le polipéptido RC-M (interactuando yéetel le ts'ono'oto' unión QB yo'osal le enlace H ti' le residuo Tyr ti' le hélice Q) adopta jump'éel conformación antinatural, yéetel le k'eexpajal conformacional QB ma' u explora asab (30 ). Ba'ax ku ts'áaik muuk'e' leti'e' ma' k wilmaj le bin yano'ob deformación ti' le polipéptido M ti' le ba'ax RC-LH114-W, ba'ax le óol le k'iino' je'el xano' bey le región N-terminal ti' RC-LH116 RC. Xan k'a'ana'an u observado u ka' u erradicación le antena LH1 basada ti' detergente, le RCs apolipoproteína ti' le PDB bino'ob resueltos, ku eliminaron le piscinas quinona interna yéetel lípidos ti' le brecha ichil le RC yéetel le superficie interior ti' le ts'ipit k'ab LH1 circundante (31, 32). RC ku p'áatal meyaj tumen ku p'áatal tuláakal le cofactores, excepto le quinona QB descomposable, ba'ax le menos estable yéetel tu menudo ku sa'atal ichil le tuukula' preparación (33). Beyxan, u yojel u le eliminación LH1 yéetel lípidos cíclicos ku yúuchul ti' RC je'el u páajtal u yaantal jump'éel impacto ti' le noj, bey le kuxtal útil acortada ti' le kuuch-separado P + QB-noj (31, 34, 35). Le o'olale', k especulamos u yaantal le ts'ipit k'ab LH1 local rodeando le RC je'el u páajtal u mantener le ts'ono'oto' QB "cerrado", conservando bey le entorno local naats' le QB.
Kex le apolipoproteína (xma' quinona QB) yéetel le ba'ax completa representan chéen ka'ap'éel instantáneas ti' le volumen negocios le ts'ono'oto' QB, kúuchil jump'éel serie k'inbesajo'ob, yaan indicaciones ti' le unión je'el u páajtal u cerrada utia'al Jech u reunión tumen hidroquinona Utia'al u inhibir le inhibición sustrato. Le interacción quinolol yéetel quinona naats' le ts'ono'oto' QB ti' le apolipoproteína je'el u páajtal u jela'an, ku conduce ti' u rechazo tumen RC. Ts'o'ok u ya'ab k'iin u ya'ala'ale' le cambios conformacionales ku báaxal jump'éel ju'un ti' le unión yéetel le reducción le quinonas. Le Buka'aj u ba'al u RCs congelados utia'al u xu'ulsiko'ob le quinonas ka' u adaptación éek'joch'e'en táan deteriorada (36); Le cristalografía tumen rayos X ku ye'esik u le loob ku yúuchul tumen le quinonas QB táan atrapadas ti' jump'éel conformación "distal" yan 4.5 Å tak le posición proximal activa (26) , 37). K sugerimos u le conformación unión distal jach jump'éel instantánea le noj intermedio ichil le apolipoproteína yéetel le ba'ax ts'ipit k'ab k'iini', ku Chúuns le interacción inicial yéetel le quinona yéetel le apertura le ts'ono'oto' QB.
Le bin yano'ob II RC encontrado ti' le complejo PSII u ciertas bacterias fototróficas yéetel cianobacterias, algas yéetel paak'alo'ob yaan ti' conservación estructural yéetel funcional (38). Le alineación estructural ku ye'esik ti' le yoochel 6 (D yéetel E) enfatiza le similitud ichil PSII RCs yéetel le ts'ono'oto' QB ti' le complejo RC bacteriano. Le comparación ts'o'ok u sido jump'éel bix utia'al u xook le kaambalilo'ob estrechamente relacionados ti' le unión yéetel reducción quinona. Le publicaciones máako'ob síinajo'obo' sugirieron u le cambios conformacionales ku acompañan tumen le reducción PSII ti' le quinonas (39, 40). Le o'olale', considerando le conservación evolutiva ti' RC, le mecanismo unión ma' observado ka'ache' xan je'el u páajtal u aplicable ti' le ts'ono'oto' QB ti' PSII RC ti' paak'alo'ob fototróficas oxigenadas.
Rps ΔpufW (deleción pufW ma' etiquetada) yéetel PufW-His (C-terminal 10x His-etiquetado proteína-W expresado tak le locus pufW ku yúuchul) cepas. palustris CGA009 bin descrito ti' k meyaj anterior (16). Le k'iino'oba' cepas yéetel le isogénico wild-type parents bino'ob recuperados ti' le congelador tumen rayar jump'éel chan meyaj ku u células ti' PYE (Cada 5 g litro -1) (almacenado ti' LB ti' -80 ° C, ku taasik 50% ( w leti' v) glicerol) proteína, extracto levadura yéetel succinato) agar [1.5% leti' v) placa. Le placa bin incubada ichil áak'ab ti' le éek'joch'e'enil ti' temperatura ambiente yáanal condiciones anaeróbicas, ka tu láak' iluminada yéetel sáasil sak (~ 50 μmolm-2 s-1) proporcionada tumen bombillas halógenas OSRAM 116-W (RS Components, UK) ichil 3 u 5 k'iino'ob tak ka chíikpaj jump'éel tin juunal colonia. Utia'al u inocular 10 ml u chúumuk M22+ (41) meyajnaj jump'éel chéen colonia (41) yéetel 0.1% (p/v) ácidos casamino (ti' le k'iino'oba' ku k'aaba'tik M22). Le miatsilo' ku pak'a'al yáanal condiciones bajas ti' oxígeno ti' le éek'joch'e'enil ti' 34°C yéetel agitación ti' 180 rpm ichil 48 horas, ka tu láak' 70 ml ti' le miatsil bin inoculada yáanal le bak'paach condiciones ichil 24 horas. Juntúul cultivo semi-aeróbico yéetel juntúul volumen 1 ml ku meyajtiko'ob utia'al u inocular 30 ml u chúumuk M22 ti' jump'éel botella vidrio transparente universal u tornillo 30 ml yéetel irradiado yéetel agitación (~ 50μmolm-2 s-1) ichil 48 horas tumen muuk' magnética estéril Stirring rod. Tu láak' 30 ml ti' le miatsil bin inoculada yéetel yan 1 litro miatsil yáanal le bak'paach condiciones, ku bin utilizado utia'al u inocular yan 9 litros miatsil iluminada ti' ~ 200 μmolm-2 s-1 ichil 72 horas. Le células bino'ob cosechadas tumen centrifugación ti' 7132 RCF ichil 30 minutos, resuspendidas ti' ~ 10 ml u 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ka almacenadas ti' -20 ° c tak ka k'a'abéet.
Ka' ts'o'ok u descongelar, añadir yaan cristales u desoxirribonucleasa I (Merck, Reino Unido), lisozima (Merck, Reino Unido) yéetel ka'ap'éel tabletas inhibidoras u proteasa holoenzima Roche (Merck, Reino Unido) ti' le células resuspendidas. Ti' jump'éel célula presión francesa 20.000 psi (Aminco, USA), le células bino'ob interrumpidas 8 u 12 Óoxten. Ka' luk'sa'al le células ma' jaatik yéetel le escombros ma' solubles tumen centrifugación ti' 18.500 RCF ichil 15 minutos ti' 4 ° c, le membrana bin precipitada ti' le lisado pigmentado tumen centrifugación ti' 113.000 RCF ichil 2 horas ti' 43.000 ° c. P'atik le fracción soluble yéetel k'a' suspender le membrana boonil ti' 100 u 200 ml u 20 mM tris-HCl (pH 8.0) yéetel homogeneizar tak ka mina'an agregados visibles. Le membrana suspendida bin u incubada ti' 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) ku taasik 2 ti chúumuk (p/v) β-DDM ichil 1 p'isib ti' le éek'joch'e'enil ti' 4 ° c yéetel agitación O'olkij. Tu láak' centrifuga ti' 70°C utia'al u disolver 150.000 RCF ti' 4°C ichil 1 p'isib utia'al u luk'ul Teeche' insolubles residuales.
Le membrana solubilizante ti' le cepa ΔpufW bin aplicada ti' jump'éel columna intercambio iones sefarosa DEAE 50 ml yéetel óoxp'éel volúmenes columna (CV) u tampón unión [20 mM tris-HCl (pH 8.0) ku taasik 0.03 ti chúumuk (w leti' v) β-DDM]. P'o'ik le columna yéetel ka'ap'éel tampón unión CV, ka tu láak' p'o'ik le columna yéetel ka'ap'éel tampón unión ku ya'alik 50 mM NaCl. Le complejo RC-LH116 bin u eluido yéetel juntúul gradiente lineal u 150 u 300 mM NaCl (ti' tampón unión) ti' 1,75 CV, yéetel le complejo unión restante bin u eluido yéetel juntúul tampón unión ku taasik 300 mM NaCl ti' 0,5 CV. Mool le espectro absorción ichil 250 yéetel 1000 nm, mantener le fracción yéetel relación absorción (A880 leti' A280) asab u 1 ti' 880 u 280 nm, diluir ka'ap'éel Óoxten ti' le tampón unión, ka utilizar le k'iino' je'el xano' procedimiento tu ka'atéen ti' le columna DEAE Ti' le purificación. Diluir le fracciones yéetel A880 leti' A280 proporciones superiores u 1.7 yéetel A880 leti' A805 proporciones superiores u 3.0, meentik le tercera ronda intercambio iones, ka retener fracciones yéetel A880 leti' A280 proporciones superiores u 2.2 yéetel A880 leti' A805 proporciones superiores u 5.05. Le complejo parcialmente purificado bin u concentrado u ~ 2 ml ti' jump'éel filtro centrífugo Amicon 100.000 peso molecular cut-off (MWCO) (Merck, Reino Unido), ka cargado ti' jump'éel columna exclusión Buka'aj Superdex 200 16 leti' 600 (GE Healthcare, US) ku taasik 200 mM tampón NaCl, tu láak' eluido ti' le k'iino' je'el xano' tampón CV. Much'aba le espectros absorción ti' le fracción exclusión Buka'aj, ka concentrar le espectros absorción yéetel A880 leti' A280 proporciones yóok'ol 2.4 yéetel A880 leti' A805 proporciones yóok'ol 5.8 u 100 A880, ka inmediatamente utilizar le utia'al u preparación le cuadrícula crio-TEM wa almacenamiento Mantenga ti' - 8°C tak ka k'a'abéet.
Le membrana solubilizante u cepa PufW-His bin aplicada ti' jump'éel columna HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ku taasik 200 mM NaCl yéetel 0.03% (p/p)) ti' tampón IMAC ( GE Healthcare). v) β-DDM]. Le columna bin lavada yéetel Kanp'éel CVs u tampón IMAC, ka tu láak' yéetel Kanp'éel CVs u tampón IMAC ku taasik 10 mM histidina. Le complejo núcleo bin u eluido ti' le columna yéetel Kanp'éel tampón IMAC ku ya'alik 100 mM histidina. Le fracción ku taasik le complejo RC-LH114-W ku concentra ti' ~ 10 ml ti' jump'éel tanque agitado equipado yéetel juntúul filtro Amicon 100.000 MWCO (Merck, Reino Unido), diluido 20 Óoxten yéetel tampón unión, ka tu láak' añadido ti' 25 ml Ti' le columna DEAE Sepharose, kantúul CVs ku utilizan ti' le tampón b advance. P'o'ik le columna yéetel kantúul tampón unión CV, ts'o'okole' eluir le complejo ti' Ukp'éel CVs ti' jump'éel gradiente lineal u 0 u 100 mM NaCl (ti' tampón unión), yéetel le restantes kantúul CVs ku ya'alik 100 mM tampón unión Le complejos residuales eluidos ti' le cloruro sodio combinado yéetel le relación A/2008 asab ka'anal A880 leti' A805 relación asab ka'anal u 4.6 fracciones bino'ob concentradas u ~ 2 ml ti' jump'éel filtro centrífugo Amicon 100.000 MWCO, ka Chuup yéetel 1.5 CV IMAC tumen adelantado Tampón equilibrado Superdex 200 16 leti' 600 Buka'aj columna exclusión, ka tu láak' eluido ti' le bak'paach tampón yóok'ol 1.5 CV. Much'aba le espectros absorción ti' le fracciones Buka'aj-exclusión yéetel concentrar le espectros absorción yéetel A880 leti' A280 proporciones yóok'ol 2.1 yéetel A880 leti' A805 proporciones yóok'ol 4.6 u 100 A880, ku utilizan inmediatamente utia'al u preparación cuadrícula TEM congelada wa almacenadas ti' -80 ° C tak k'a'abéet.
Utia'al u preparar rejillas TEM baja temperatura bin utilizado jump'éel congelador Leica EM GP inmersión. Le complejo bin diluido ti' tampón IMAC u A880 u 50, ka tu láak' 5μl bin cargado ti' jump'éel malla cobre recubierto u carbono QUANTIFOIL 1.2 leti' 1.3 recién descargado tumen resplandor (Agar Scientific, Reino Unido). Incuba le rejilla ti' 20 ° c yéetel 60 ti chúumuk humedad relativa ichil 30 s, ts'o'okole' borrar tikin ichil 3 s, ka tu láak' apagar ti' etanol líquido ti' -176 ° c.
Le datos ti' le complejo RC-LH114-W bino'ob registrados ti' le eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) yéetel juntúul microscopio Titan Krios, ku meyaj ti' jump'éel voltaje aceleración u 300kV, yéetel juntúul aumento nominal u 130.000 × yéetel juntúul energía Choose jump'éel brecha 20 eV. Utia'al u k'a'abetkuunsa'al máak ti' modo u xookil uti'al u much'ik datos, meyajnaj jump'éel Gatan 968 GIF Quantum yéetel detector u pico K2. Le Buka'aj píxel calibrado jach 1.048Å, yéetel le tasa dosis jach 3.83 e-Å-2s-1. tin much'aj le cha'ano' ichil 11 segundos ka tin jatsaj ti' 40 jaatso'ob. Meyaj le kúuchil yaan carbono uti'al u ka'a enfocar le microscopio, ka tu láak' much'ik óoxp'éel películas tumen jool. Tu láakal, 3130 películas bino'ob recogidas, yéetel valores desenfoque ichil -1 yéetel -3μm.
Le datos uti'al le complejo RC-LH116 bino'ob recogidos utilizando le k'iino' je'el xano' microscopio ti' le Laboratorio Bioestructura Asterbury (Universidad u Leeds, Reino Unido). Le datos bino'ob recogidos ti' modo conteo yéetel juntúul aumento 130 k, ka le Buka'aj le píxel bin calibrado u 1.065 Å yéetel juntúul dosis 4.6 e-Å-2s-1. Le cha'ano' bin grabada ti' 12 segundos ka jats ti' 48 pak'chaje'. Tu láakal, 3359 películas bino'ob recogidas, yéetel valores desenfoque ichil -1 yéetel -3μm.
Tuláakal le procesamiento datos ku beeta'al ti' le tubería Relion 3.0 (42). Meyaj Motioncorr 2 (43) utia'al u corregir le movimiento le viga tumen ponderación dosis, ka tu láak' meyaj CTFFIND 4.1 (44) utia'al u determinar le parámetro CTF (función transferencia contraste). Le fotomicrografías típicas ka' le k'iino'oba' p'isibij procesamiento inicial ku muestran ti' le yoochel 2. S16. Le plantilla selección automática ku genera tumen selección manualmente yan 250 píxeles u 1000 partículas ti' jump'éel marco 250 píxeles yéetel ma' clasificación bidimensional (2D) u referencia, rechazando tune' aquellas clasificaciones ku cumplen yéetel le contaminación le muestra wa mina'an ti'ob mix jump'éel característica discernible. Tu láak', u selección automática u realizó ti' tuláakal le microfotografías, ka le RC-LH114-W bin 849.359 partículas, ka le complejo RC-LH116 bin 476.547 partículas. Tuláakal le partículas seleccionadas ts'o'ok u máan ka'ap'éel rondas u clasificación 2D ma' referencia, ka ka' Amal carrera, le partículas ku cumplen yéetel le yo'osal u carbono, contaminación le muestra, ma' yáantajo'ob obvias wa partículas fuertemente superpuestas ku rechazan, ts'áaik tumen resultado 772.033 (90.9%) yéetel 359.678 (75.5%) partículas u clasificación 3D ku utilizan RC-LH114-W yéetel RC-LH116 respectivamente. Le bix u k'a'ana'anil 3D inicial bin u generado utilizando le método descenso gradiente estocástico. Utilizando le modelo inicial bey jump'éel k'a'ana'an, le partículas seleccionadas ku clasifican ti' kan categorías ti' 3D. Utilizando le bix ti' le categoría bey jump'éel k'a'ana'an, meentik refinación 3D ti' le partículas ti' le categoría asab nojoch, ts'o'okole' meyaj le filtro paso t'okik 15Å inicial utia'al u pixik le yo'osal u disolvente, añadir 6 píxeles u bordes suaves, ka post-procesar le píxeles utia'al u corregir le función transferencia modulación pico Gatan K2 ti' le detector superior. Utia'al u conjunto datos RC-LH114-W, le modelo inicial bin modificado tumen eliminación le k'a'am densidad ti' le bordes le máscara (desconectado ti' le densidad complejo núcleo ti' UCSF Quimera). Le modelos resultantes (le resoluciones RC-LH114-W yéetel RC-LH116 ku 3.91 yéetel 4.16 Å, respectivamente) ku utilizan bey jump'éel k'a'ana'an utia'al u segunda ronda u clasificación 3D. Le partículas utilizadas ku agrupan ti' le xook 3D inicial yéetel ma' ku taasik k'a'am correlación yéetel le vecindario. Superposición wa si'ipil yáantajo'ob estructurales obvias. Ka' u ka'a ronda u clasificación 3D, le categoría yéetel le asab ka'anal resolución bin seleccionada [Utia'al u RC-LH114-W, jump'éel categoría jach 377.703 partículas (44.5%), utia'al RC-LH116, yaan ka'ap'éel categorías, totalizando 260.752 partículas (54.7 W h), chéen le k'iino' je'el xano' ka' leti'obe' yáax rotación yéetel jump'éel chan jela'anil]. Le partículas seleccionadas ku ka'a jóok'sa'al ti' jump'éel máabeno' 400 píxeles yéetel ku refinar tumen refinación 3D. Le máscara disolvente ku genera utilizando le filtro paso t'okik 15Å inicial, expansión mapa 3 píxeles yéetel máscara O'olkij 3 píxeles. Utilizando refinación CTF tumen partícula, corrección movimiento tumen partícula yéetel le segunda ronda u refinación CTF tumen partícula, refinación 3D, enmascaramiento disolvente yéetel post-procesamiento ku realizan ka' Amal paso utia'al u refinar asab le textura resultante. Utilizando le FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) u tojol 0.143, le resoluciones le modelos finales u RC-LH114-W yéetel RC-LH116 ku 2.65 yéetel 2.80Å, respectivamente. Le curva FSC ti' le modelo final ku ye'esik ti' le yoochel 2. S17.
Tuláakal le secuencias proteínas ku descargan ti' UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Proteína-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) bin utilizado utia'al u construir jump'éel bix u homología u RC, ku analte'obo' yaan le secuencias proteínas u RC-L, RC-M yéetel RC-H yéetel le ba'ax cristalina u Rba. sphaeroides RC bin utilizado bey juntúul plantilla (PDB ID: 5LSE) (46). Meyaj le nu'ukula' "mapa ajuste" ti' UCSF Chimera utia'al u ajustar le bix generado ti' le mapa (47), ma'alo'obkíinsiko'ob u ba'ax le proteína, ka cofactor [4 × BChl jump'éel (k'aaba' residuo biblioteca monómero = BCL), 2 × BPh jump'éel (BPH), jump'éel wa ka'ap'éel tipos UQ10 (U10), jump'éel hierro ma' hemo (Fe) yéetel jump'éel hexadicolina, 34 (QAK)] meyaj Coot (48) uti'al u ts'áabal. Tuméen QAK ma' táan disponible ti' le biblioteca monómeros, bin parametrizado utilizando le nu'ukula' eLBOW ti' PHENIX (49).
Tu láak', le subunidad LH1 bin construida. Tu káajbale', le nu'ukula' construcción automática ti' PHENIX (49) bin utilizada utia'al u construir automáticamente jump'éel nu'ukulil le secuencia LH1 utilizando le mapa yéetel le secuencias proteínas LH1-α yéetel LH1-β bey entrada. Yéey le subunidad LH1 asab completa, jóok'sik ka kuuch ti' Coot, añadir manualmente le secuencia faltante ti' leti', ka refinar manualmente le ba'ax entera bey ma' añadir ka'ap'éel BCls jump'éel (BCL) yéetel juntúul espiriloxantina (CRT) [bin le Rps pertinente Le densidad le complejo LH1 yéetel le contenido carotenoide k'ajóolta'an. Especies (17)]. Copiar le subunidad LH1 completa, ka meyaj le UCSF Quimera "Docking Map Tool" utia'al u atracar ti' le yo'osal adyacente ma' modelo u densidad LH1, ka tu láak' refinar tu ti' Coot; repetir le tuukula' tak ka tuláakal le subunidades LH1 séen sido modeladas. Utia'al u ba'ax RC-LH114-W, tumen extraer le densidad ma' asignada ti' le Coot, le proteína ku segmenta ti' le componentes ma' proteínas restantes ti' le mapa Quimera USCF yéetel le nu'ukula' Autobuild ku meyajtiko'ob utia'al establecer le bix inicial, yéetel le subunidades restantes (proteína-W) Modelado. Ti' PHENIX (49). Añadir je'el ba'ax secuencia faltante ti' le bix resultante ti' Coot (48), ka tu láak' refinar manualmente le subunidad entera. Le densidad ma' asignada ku p'áatal ku bin yéetel le combinación lípidos (ID u biblioteca monómero PDB ti' CDL = CDL, POPC = 6PL yéetel POPG = PGT), detergente β-DDM (LMT) yéetel moléculas UQ10 (U10). Meyaj le optimización PHENIX (49) yéetel le optimización manual ti' Coot (48) utia'al u perfeccionar le bix inicial completa tak ka le estadísticas bix yéetel le ma'alobil visual ti' le ajuste ma' táan u béeytal u mejoradas asab. Tu ts'ooke', meyaj LocScale (50) utia'al u afilar le mapa local, ka tu láak' meentik ya'ab uláak' ciclos u modelado le densidad ma' asignada yéetel optimización automática yéetel manual.
Le péptidos, cofactores yéetel uláak' lípidos yéetel quinonas atracados ichil u respectivas densidades ku muestran ti' le figuras 1 yéetel 2. S18 u S23. Le a'alajil t'aan estadística ti' le modelo final ku ye'esik ti' le cuadro S1.
Wa ma' u ya'ala'al uláak' bix ken, le espectros absorción UV leti' Vis leti' NIR bino'ob recogidos ti' jump'éel espectrofotómetro Cary60 (Agilent, USA) ti' intervalos 1 nm u 250 nm u 1000 nm yéetel jump'éel k'iin integración 0.1s.
Diluir le muestra ti' jump'éel cubeta cuarzo yéetel juntúul bejil 2 mm u A880 u 1, ka recoger le espectro absorción ichil 400 yéetel 1000 nm. Le espectros dicróicos circulares bino'ob recogidos ti' jump'éel espectropolarímetro Jasco 810 (Jasco, Japón) ti' intervalos 1 nm ichil 400 nm yéetel 950 nm ti' jump'éel velocidad exploración 20 nm min-1.
Le coeficiente extinción molar ku determina tumen diluir le complejo núcleo ti' jump'éel A880 u yan 50. Diluir le volumen 10μl ti' 990μl tampón unión wa metanol, ka recoger le espectro absorción inmediatamente utia'al u minimizar le degradación BChl. Le contenido BChl ti' Amal muestra metanol bin calculado tumen le coeficiente extinción ti' 771 nm u 54.8 mM-1 cm-1, ka le coeficiente extinción bin determinado (51). Jat le concentración BChl medida tumen 32 (RC-LH114-W) wa 36 (RC-LH116) utia'al u determinar le concentración complejo núcleo, ku ts'o'okole' ku meyajtiko'ob utia'al determinar le espectro absorción ti' le bak'paach muestra recogida ti' le coeficiente extinción tampón. paralelóo. Óoxp'éel mediciones repetidas u ch'a'abal utia'al Amal muestra, ka u absorción chúumuk le máximo BChl Qy u utilizado utia'al u cálculo. Le coeficiente u extinción RC-LH114-W medido ti' 878 nm jach 3280±140 mM-1 cm-1, ka' jo'op' u le coeficiente extinción RC-LH116 medido ti' 880 nm jach 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 bin cuantificado bin le método ti' (52). Tu ke, HPLC fase inversa (RP-HPLC) u realizó utilizando le yaan HPLC Agilent 1200. Disolver yan 0.02 nmol u RC-LH116 wa RC-LH114-W ti' 50μl u 50:50 metanol:cloroformo ku taasik 0.02% (p/v) cloruro férrico, ka inyectar le pre-equilibrado Beckman Coulter Ultrasfera 4 mml disolver ti' 1-1-m 40°C ti' disolvente HPLC (80:20 metanol:2-propanol) ti' jump'éel columna ×25 cm. Meentik elución isocrática ti' jump'éel disolvente HPLC utia'al u monitorear le absorción ti' 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoides) yéetel 780 nm (BChl) ichil 1 p'isib. Le pico ti' le cromatograma 275 nm ti' 25.5 minutos bin integrado, ba'ax ma' contenía mix uláak' compuestos detectables. Le yo'osal integrada ku meyajtiko'ob utia'al u calcular le cantidad molar u UQ10 extraída yéetel referencia ti' le curva calibración calculada ti' le inyección estándares puros u 0 u 5.8 nmol (yoochel S14). Amal muestra bin u analizada ti' óoxp'éel replicas, yéetel le ba'alo' reportado corresponde ti' le SD ti' le promedio.
Juntúul solución ku taasik le complejo RC-LH1 yéetel juntúul absorción Qy máxima u 0.1 bin preparada yéetel 30 μM reducido puksi'ik'al tsíimin citocromo c2 (Merck, Reino Unido) yéetel 0 u 50 μMUQ2 (Merck, Reino Unido). Óoxp'éel muestras 1-ml bino'ob preparadas ti' Amal concentración UQ2 yéetel incubadas ichil áak'ab ti' le éek'joch'e'enil ti' 4 ° C utia'al u asegurar le adaptación completa ti' le éek'joch'e'enil bey ma' le medición. Le solución bin u cargada ti' jump'éel espectrofotómetro modular OLIS RSM1000 equipado yéetel juntúul 300 nm llama leti' 500 internet ichil rejilla, 1,24 mm entrada, 0,12 mm chúumuk yéetel 0,6 mm ranuras salida. Juntúul filtro 600 nm chowak paso ku coloca tu jool le fototubo muestra yéetel le tubo fotomultiplicador u k'a'ana'an utia'al u excluir le sáasilo' excitación. Le absorción bin u monitoreada ti' 550 nm yéetel juntúul k'iin integración 0.15 s. Le sáasilo' excitación ku emite ti' le 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) yo'osal jump'éel cable láaj jo'ochiko'obe' óptica ti' 90% intensidad yo'osal jump'éel controlador DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) yéetel ku emite ti' le fuente sáasil ti' jump'éel ángulo u 90 °. Le viga medición ku opone ti' le néeno' utia'al u suut je'el sáasil ma' bin inicialmente absorbida tumen le muestra. Ilawil le absorción 10 s bey ma' u sáasil 50 s. Tu láak' le absorción bin u asab monitoreada ichil 60 s ti' le éek'joch'e'en utia'al u evaluar le medida ti' le quinolol reduce espontáneamente le citocromo c23 + (wil wíimbala' S8 utia'al u datos crudos).
Le datos bino'ob procesados ​​tumen ajuste jump'éel tasa inicial lineal ichil 0.5 u 10 s (dependiendo de le concentración UQ2) yéetel promediando le tasas tuláakal le óoxp'éel muestras ti' Amal concentración UQ2. Le concentración RC-LH1 calculada tumen le coeficiente extinción respectivo bin utilizada utia'al u sutk'esiko'ob le tasa ti' le eficiencia catalítica, trazada ti' Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), ka ajustada ti' le bix Michaelis-Menten utia'al u determinar le valores aparentes Km yéetel Kcat.
Utia'al u mediciones absorción transitoria, le muestra RC-LH1 bin diluida u ~ 2μM ti' tampón IMAC ku taasik 50 mM ascorbato sodio (Merck, USA) yéetel 0.4 mM Terbutina (Merck, USA). Le ácido ascórbico ku meyajtiko'ob bey donante electrones sacrificiales, yéetel tert-butaclofeno ku meyajtiko'ob bey inhibidor QB utia'al u asegurar ti' u le donante RC noj bejo' permanece reducido (es decir, ma' fotooxidado) ichil le tuukula' medición. Óoli' 3 ml u muestra ku ts'áabal ti' jump'éel célula giratoria personalizada (yan 0.1 m ti' metros, 350 RPM) yéetel juntúul longitud bejil óptica 2 mm utia'al u asegurar ti' u le muestra ti' le bejil láser yaan suficiente k'iin utia'al u adaptación éek'joch'e'en ichil pulsos excitación. Meyaj pulsos láser ~100-fs utia'al u amplificar le yaan láser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) utia'al u excitar le muestra ti' 880 nm ti' jump'éel tasa repetición 1 kHz (20 nJ utia'al u NIR wa 100 nJ utia'al u Vis). Táanil ti' u much'ik datos, exponer le muestra ti' le sáasilo' excitación ichil yan 30 minutos. Le exposición yaan u causar inactivación QA (páajtal u xu'ulsiko'ob QA juntéene' wa ka'ap'éel Óoxten). Ba'ale' yanak ti' tu yilaje' u le tuukula' jach reversible tuméen ka' jump'éel chowak período adaptación éek'joch'e'en, RC Chaambel yaan u suut ti' le actividad QA. Juntúul espectrómetro Helios (Ultrafast Systems, USA) bin utilizado utia'al u P'iis espectros transitorios yéetel juntúul k'iin retraso u -10 u 7000 ps. Meyaj software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) uti'al u jats'ik le datos, ts'o'okole' unir yéetel estandarizar. Meyaj le paquete software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) utia'al u utilizar le conjunto datos combinados utia'al u kéen p'áatak espectros diferenciales relacionados yéetel le desintegración, wa meyaj juntúul función ku convolve ya'ab k'oja'ano'ob exponentes yéetel le núukik le instrumento utia'al u ajustar le evolución espectral u chéen longitud onda ti' Origin (OriginLab, USA).
Bix u ya'ala'al ka'anal (53), u preparado jump'éel cha'ano' fotosintética ku taasik complejo LH1 mina'an ti' RC yéetel antena LH2 periférica. Le membrana bin diluida ti' 20 mM tris (pH 8.0) ka tu láak' kuuch ti' jump'éel cubeta cuarzo yéetel juntúul bejil óptica 2 mm. Utia'al u excitar le muestra ti' 540 nm yéetel jump'éel k'iinil retraso -10 u 7000 ps, ​​meyajnaj jump'éel pulso láser 30nJ. Meyaj le tsol datos bey descrito utia'al u Rps. pal muestra.
Le membrana bin u pelletizada tumen centrifugación ti' 150.000 RCF ichil 2 horas ti' 4 ° c, ka tu láak' u absorción ti' 880 nm bin resuspendida ti' 20 mM tris-HCl (pH 8.0) yéetel 200 mM NaCl. Disolver le membrana tumen revuelva Chaambel ti' 2% (p/v) β-DDM ichil 1 p'isib ti' le éek'joch'e'enil ti' 4°C. Le muestra bin diluida ti' 100 mM carbonato trietilamonio (pH 8.0) (TEAB; Merck, Reino Unido) ti' jump'éel concentración proteína u 2.5 mg ml-1 (análisis Bio-Rad). Uláak' procesamiento bin u bisik ka'ansaj tak le método publicado ka'ache' (54), ku káajal le yéetel le dilución 50 μg proteína ti' jump'éel total u 50 μl TEAB ku taasik 1 ti chúumuk (p/v) laurato sodio (Merck, Reino Unido). Ka' sonicación ichil 60 s, bin reducido yéetel 5 mM tris (2-carboxyethyl) fosfina (Merck, Reino Unido) ti' 37 ° c ichil 30 minutos. Utia'al u S-alquilación, incubar le muestra yéetel 10 mM metilo S-metiltiometanosulfonato (Merck, Reino Unido) yéetel añadir ti' jump'éel solución stock isopropanol 200 mM ichil 10 minutos u temperatura ambiente. Le digestión proteolítica u tu bisaj ka'ansaj yo'osal u adición 2 μg tripsina leti' endoproteinasa Lys-C mezcla (Promega UK) yéetel incubado ti' 37 ° c ichil 3 horas. Le tensioactivo laurato bin extraído yo'osal u adición 50 μl acetato etilo yéetel 10 μl 10 ti chúumuk (v leti' v) ácido trifluoroacético grado LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) yéetel vortex ichil 60 s. Le separación fase bin u promovida tumen centrifugación ti' 15.700 RCF ichil 5 minutos. Je'el bix u ya'alik u protocolo le fabricanteo', meyajnaj jump'éel columna spin C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) uti'al u aspirar yéetel u desalar le fase inferior ku taasik le péptido. Ka' u secado tumen centrifugación ti' vacío, le muestra bin u disuelta ti' 0,5 ti chúumuk TFA yéetel 3 ti chúumuk acetonitrilo, ka 500 ng bin analizado tumen cromatografía RP nanoflujo acoplado yéetel espectrometría ti' juuch' utilizando le parámetros le yaan detallados ka'achij.
Meyaj MaxQuant v.1.5.3.30 (56) uti'al u identificación yéetel cuantificación proteínas uti'al u kaxtik Rps. k'oja'ano'obo' u datos u proteoma palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Le datos proteómicos u espectrometría u masas u ts'o'ok depositado ti' le Alianza ProteomeXchange yo'osal le repositorio socio PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) yáanal le identificador conjunto datos PXD020402.
Utia'al u análisis tumen RPLC acoplado yéetel espectrometría u juuch' ionización electrospray, le complejo RC-LH1 bin u preparado u Rps bin yano'ob salvaje. Utilizando le método publicado ka'ache' (16), le concentración proteína producida ti' células palustris bin 2 mg ml-1 ti' 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl yéetel 0.03% (p/v) β- (análisis Bio-Rad) ) DDM. Je'el bix u ya'alik u protocolo le fabricante, meyaj kit purificación 2D (GE Healthcare, USA) uti'al u jóok'sik 10 μg proteína tumen método precipitación, ka disolver le precipitado ti' 20 μl 60% (v leti' v) ácido fórmico (FA), 20% (v leti' v) acetonitrilo yéetel 20% (v leti' v) ja'. Kanp'éel microlitros bino'ob analizados tumen RPLC (Dionex RSLC) junto yéetel espectrometría ti' juuch' (Maxis UHR-TOF, Bruker). Meyaj MabPac 1.2×100 mm columna (Thermo Fisher Scientific, UK) utia'al u separación ti' 60°C yéetel 100μlmin -1, yéetel juntúul gradiente 85% (v leti' v) disolvente A [0.1% (v leti' v) FA yéetel 0.02% (V leti' v) TFA solución acuosa] ti' 85% (v leti' v) disolvente Bv [0.1%(v/v) FA yéetel 0.02%(v/v) ti' 90%(v/v) acetonitrilo TFA] Utilizando fuente ionización electrospray estándar yéetel parámetros tumen defecto tumen asab u 60 minutos, le espectrómetro u juuch' obtiene 100 u 2750 m leti' z (ras-carga-ratio). Yéetel u yáantaj le portal nu'ukulo'ob bioinformática ExPASy FindPept nu'ukula' (https://web.expasy.org/findpept/), mapear le espectro juuch' ti' le subunidades le complejo.
Le células bino'ob cultivadas ichil 72 horas yáanal 100 ml NF-bajo (10μMm-2 s-1), chúumuk (30μMm-2 s-1) wa ka'anal (300μMm-2 s-1) sáasil. M22 chúumuk (M22 chúumuk tu'ux ku p'atik le sulfato amonio yéetel le succinato sodio ku k'e'exel tumen acetato sodio) ti' jump'éel botella 100 ml tornillo-superior (23). Ti' jo'op'éel ciclos 30-s, 0.1 micras perlas vidrio bino'ob cuentas ti' jump'éel relación volumen 1:1 utia'al u lisar le células yéetel enfriado yóok'ol hielo ichil 5 minutos. Le ba'al ma' soluble, le células ma' jaatik yéetel le perlas vidrio bino'ob eliminados tumen centrifugación ti' 16.000 RCF ichil 10 minutos ti' jump'éel microcentrífuga encimera. Le membrana bin separada ti' jump'éel rotor Ti 70.1 yéetel 100.000 RCF ti' 20 mM tris-HCl (pH 8.0) yéetel juntúul gradiente sacarosa 40 leti' 15 ti chúumuk (p leti' p) ichil 10 horas.
Bix u ya'ala'al ti' k meyaj máaniko', inmunodetección ti' le etiqueta His ti' PufW (16). Tu ke, le complejo núcleo purificado (11.8 nM) wa le membrana ku taasik le bak'paach concentración RC (determinada tumen oxidación restando le espectro jela'anil in reducido yéetel coincidiendo yéetel le kuuch ti' le gel manchado) ti' 2 x SDS kuuch tampón (Merck, Reino Unido) diluido ka'ap'éel Óoxten. Le proteínas bino'ob separadas ti' jump'éel réplica 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). jump'éel gel bin manchado yéetel Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) uti'al u kuuch yéetel u yila'al le subunidad RC-L. Le proteína ti' le segunda gel bin u transferida ti' le membrana fluoruro polivinilideno activado tumen metanol (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) utia'al u inmunoensayo. Le membrana PVDF bin bloqueada ti' 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v leti' v) Tween-20 yéetel 5% (p leti' v) juuch'bil yiim descremada, ka tu láak' incubada yéetel le anticuerpo primario anti-His (ti' Diluir le tampón anticuerpo [50 mM tris-HCl (HMHMl). 7.6), 150 mM NaCl yéetel 0.05% (v/v) Tween-20] ti' 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) ichil 4 horas. Ka' p'o'ik 3 Óoxten ichil 5 minutos ti' tampón anticuerpo, le membrana bin combinada yéetel peroxidasa rábano (Sigma-Aldrich, Reino Unido) anticuerpo p'iskaambal anti-ch'o' (diluido 1:10.000 ti' tampón anticuerpo) Incuba utia'al u permitir le detección (5 minutos ka' 3 lavados ti' tampón anticuerpo) utilizando WAR 2000 sustrato u quimioluminiscencia (Cyanagen, Italia) yéetel Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Reino Unido).
Yo'osal u boonol le distribución intensidad Amal gel manchado wa carril inmunoensayo, integrando le yo'osal yáanal le pico yéetel calculando le relación intensidad RC-L (gel manchado) yéetel Protein-W (inmunoensayo), ti' ImageJ (57) Procesar le wíimbala'. Le k'iino'oba' proporciones bino'ob convertidas ti' proporciones molares suponiendo u le relación RC-L u proteína-W ti' le muestra Chen séen RC-LH114-W bin 1:1 yéetel normalizando le conjunto datos entero tu consecuencia.
Utia'al u láak' ba'alo'ob uti'al le artículoa', wil http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
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David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Andrew C. Necoil Necoil
Le ba'ax ka'anal resolución ti' le complejo trampa sáasil 1 ti' le chúumukil reacción proporciona túumben visión ti' le dinámica le quinona.
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©2021 Asociación Americana utia'al u táanil le ciencia. tuláakal u páajtalilo'ob. AAAS leti' jump'éel socio ti' HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef yéetel COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.