Bejla'e' *Dirección actual: Colonia 50931, Alemania, Colonia Excelencia Clúster Investigación ti' le núukik estrés celular ti' k'aas k'oja'anilo'obo' relacionadas yéetel le envejecimiento (CECAD).
Le neurodegeneración ti' le k'oja'anilo'ob mitocondriales ku yila'al bey irreversible tuméen le plasticidad metabólica ti' le neuronas jach limitada, ba'ale' le efecto le disfunción mitocondrial ti' le autonomía celular ti' le metabolismo neuronal ti' u wíinkilal jach k'aas entendido. Te'ela', k ts'áaik ojéeltbil le proteoma específico ti' le células ti' le neuronas Purkinje yéetel deficiencia progresiva ti' OXPHOS causada tumen le dinámica fusión mitocondrial interrumpida. K encontramos u le disfunción mitocondrial desencadenó jump'éel k'eexpajal profundo ti' le sikte proteómica, tu ts'ook instancia condujo ti' le activación secuencial ti' programas metabólicos precisos bey ma' u kíimile' le células. Ma' k pa'atik, k determinamos le inducción obvia ti' le piruvato carboxilasa (PCx) yéetel uláak' peroxidasas relacionadas yéetel le suplementación le intermedios ciclo TCA. Le inhibición PCx exacerbó le estrés oxidativo yéetel le neurodegeneración, ku ye'esik u le aterosclerosis yaan jump'éel efecto protector ti' le neuronas mina'an ti'ob OXPHOS. U ka'a suut le fusión mitocondrial ti' le neuronas terminalmente degeneradas ku sutk'esiko'ob jaatsatako'ob le k'iino'oba' yáantajo'ob metabólicas, bey u previene u kíimile' le células. K hallazgos identifican vías desconocidas ka'ache' ku confieren resiliencia ti' le disfunción mitocondrial yéetel muestran u le neurodegeneración je'el u páajtal u invertida páajtal ti' le p'isibij finales ti' le k'oja'anil.
U noj meyaj le mitocondrias ti' le mantener le metabolismo energía neuronal ku enfatiza tumen le amplios síntomas neurológicos asociados yéetel k'aas k'oja'anilo'obo' mitocondriales humanas. Óol tuláakal le máasewáalo'obo' ti' le k'oja'anilo'oba' ku causan tumen mutaciones genéticas ku regulan le expresión genética mitocondrial (1, 2) wa destrucción genética relacionada yéetel le dinámica mitocondrial, ku afectan indirectamente le estabilidad ADN mitocondrial (mtDNA) (3, 4). Meyaj ti' modelos ba'alche'ob ts'o'ok u demostrado u ti' núukik le disfunción mitocondrial ti' le tejidos circundantes, vías metabólicas conservadoras (5-7) páajtal u activadas, proporcionando bey importantes percepciones ti' le patogénesis le k'oja'anilo'obo' complejas. Tu jela'anil, k na'atik le cambios metabólicos ti' tipos celulares específicos causados ​​tumen le fracaso general ti' le producción adenosina trifosfato (ATP) mitocondrial cerebral jach fundamental (8), enfatizando u necesidad u identificar objetivos terapéuticos u páajtal u utilizados utia'al u Je'e bix u páajtale' wa Je'e bix u páajtale' le k'oja'anil. Je'elel le neurodegeneración (9). Le si'ipil a'alajil t'aan jach u jaajile' ti' u le células nerviosas ku ampliamente consideradas yaantal flexibilidad metabólica jach limitada ti' comparación yéetel le tipos celulares u tejidos circundantes (10). Tuméen le k'iino'oba' células ku báaxal jump'éel ju'un k'ajle' ti' le coordinación le suministro metabolitos ti' le neuronas utia'al u fomentar le transmisión sináptica yéetel núukik le condiciones le loobo' yéetel k'oja'anil, le Buka'aj u ba'al utia'al adaptar le metabolismo celular ti' le condiciones desafiantes u wa'ak'al cerebral óol limitada ti' le células gliales (11-14). Beyxan, le heterogeneidad celular inherente ti' u wa'ak'al cerebral tu gran medida obstaculiza le xooko' le cambios metabólicos ku yúuchul ti' subgrupos neuronales específicos. Bey resultado, jump'íit ba'ax k ojel yóok'ol le consecuencias celulares yéetel metabólicas exactas ti' le disfunción mitocondrial ti' le neuronas.
Utia'al u na'ata'al le consecuencias metabólicas ti' le disfunción mitocondrial, aislamos neuronas Purkinje (PNs) ti' jejeláas p'isibij neurodegeneración causada tumen le destrucción fusión membrana exterior mitocondrial (Mfn2). Kex le mutaciones Mfn2 ti' le wíiniko'obo' ku asocian yéetel jump'éel bix u neuropatía sensorial motora hereditaria k'ajóolta'an je'el bix Charcot-Marie-Tooth bin yano'ob 2A (15), le destrucción condicional ti' Mfn2 ti' le ch'o'obo' jach jump'éel inducción ma'alob reconocida ti' le método disfunción fosforilación oxidación (OXPHOS). Le jejeláas subtipos neuronales (16-19) yéetel le fenotipo neurodegenerativo resultante ku láak'inta'al tumen síntomas neurológicos progresivos, bey trastornos movimiento (18, 19) wa ataxia cerebelosa (16). Yo'osal u búukinta'al jump'éel combinación proteómica cuantitativa xma' etiqueta (LFQ), metabolómica, imágenes, yéetel métodos virológicos, k e'esik u neurodegeneración progresiva induce fuertemente le piruvato carboxilasa (PCx) yéetel uláak' ba'ax ku táakpajalo'ob ti' le arteriosclerosis PNs in vivo Le expresión enzimas. Utia'al u yila'al u k'a'ana'anil le ba'ala', k específicamente down-regulated le expresión PCx ti' PNs deficientes ti' Mfn2, ka tu kaxtaj u le operación agravó le estrés oxidativo yéetel aceleró le neurodegeneración, demostrando bey u le azoospermia confiere u kíimile' le células Adaptabilidad metabólica. Le expresión severa ti' MFN2 je'el u páajtal u salvar completamente le degeneración terminal PN yéetel deficiencia severa ti' OXPHOS, jant p'áatalij masivo u ADN mitocondrial, yéetel páawo'ob mitocondrial aparentemente Jaatal, ku enfatiza asab u le bix u neurodegeneración je'el incluso recuperar ti' le p'isibij avanzada ti' le k'oja'anil bey ma' u kíimile' le células.
Utia'al u yila'al le mitocondrias ti' le PNs knockout Mfn2, utilizamos jump'éel cepa ch'o' ku cha'antik le mitocondrias dependientes ti' Cre utia'al u dirigir u proteína fluorescente k'an (YFP) (mtYFP) (20) expresión Cre yéetel comprobamos le morfología mitocondrial in vivo. K encontramos u le destrucción le gen Mfn2 ti' PNs conduciría ti' le división gradual ti' le páawo'ob mitocondrial (Figura S1A), ka le k'eexpajal asab temprano bin u Kaxa'antbil ti' 3 semanas u ts'o'oka'an. U jela'anil, le degeneración sustancial ti' le capa celular PN, bey evidenciado tumen le asab inmunotinción Calbindin, ma' comenzado tak 12 semanas u ts'o'oka'an (yoochel 1, jump'éel yéetel B). Le k'iin ma' táan u bin ichil le yáax k'eexo'ob ti' le morfología mitocondrial yéetel le aparición visible ti' u kíimile' neuronal tu beetaj k investigar le cambios metabólicos provocados tumen le disfunción mitocondrial bey ma' u kíimile' le células. K desarrollamos jump'éel estrategia basada ti' le clasificación células activadas tumen fluorescencia (FACS) utia'al u aislar YFP (YFP +)-expresando PN (yoochel 1C), yéetel ti' ch'o'obo' kanik (Mfn2 + leti' loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ti' le presente referido bey CTRL (yoochel S1BRL). Le optimización ti' le estrategia gating basada ti' le intensidad relativa ti' le señal YFP ku cha'antik k purificar u wíinkilal YFP + (YFPhigh) u PNs u ma' PNs (YFPneg) (Figura S1B) wa putativos fragmentos fluorescentes u axón leti' dendríticos (YFPlow; Figura S1D, izquierda), confirmado tumen microscopio confocal (Figura S1D, derecha S1D). Utia'al u verificar u identidad le jo'olkaajo' clasificada, realizamos proteómica LFQ ka tu láak' análisis componentes principales, ka tu kaxtaj u yaan jump'éel separación chika'an ichil le células YFPhigh yéetel YFPneg (Figura S1C). Le células YFPhigh mostraron jump'éel enriquecimiento neto u marcadores PNs k'ajóolta'ano'ob (es decir Calb1, Pcp2, Grid2 yéetel Itpr3) (21, 22), ba'ale' ma' enriquecimiento proteínas expresadas comúnmente ti' neuronas jump'éel uláak' tipos celulares (Figura 1D) ). jump'éel comparación ichil le muestras ti' células YFPhigh clasificadas recogidas ti' experimentos independientes tu ye'esaj jump'éel coeficiente correlación> 0.9, demostrando ma'alo'ob reproducibilidad ichil réplicas biológicas (Figura S1E). Ti' Resumen, le k'iino'oba' datos validaron k plan utia'al u aislamiento agudo yéetel específico ti' le PN factible. Tuméen le yaan conductor L7-cre utilizado induce recombinación mosaico ti' le yáax semana ka' u k'u'ubul (23), comenzamos u kíinsa'al ch'o'obo' u CTRL yéetel condicional (Mfn2 loxP leti' loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Much'ik neuronas. Le ken ts'o'okok u recombinación, ku k'aaba'tik Mfn2cKO ti' 4 semanas u ts'o'oka'an. Bey u ts'ook, seleccionamos 8 semanas u ts'o'oka'an ka le capa PN láayli' ka'ach intacta a pesar ti' le fragmentos mitocondriales obvios (yoochel 1B yéetel yoochel S1A). Tu láakal, k cuantificamos jump'éel total u 3013 proteínas, ti' le ku yan 22% bino'ob basados ​​ti' anotaciones MitoCarta 2.0 basadas ti' le proteoma mitocondrial bey mitocondrias (yoochel 1E) (yoochel 1E) (24). Le análisis expresión genética diferencial realizado ti' le semana 8 tu ye'esaj u chéen 10.5% ti' tuláakal le proteínas yaan ka'ach cambios significativos (yoochel 1F yéetel yoochel S1F), ti' le ku 195 proteínas bino'ob reguladas tak kaambal yéetel 120 proteínas bino'ob reguladas tak ka'anal (yoochel 1F). K'a'ana'an u ya'ala'ale' le "análisis innovador ti' le bejo'" ti' le conjunto datos ye'esik u le genes expresados ​​diferencialmente pertenecen chuunil laat'a'an ti' jump'éel múuch' restringido u vías metabólicas específicas (yoochel 1G). Jach jats'uts, kex le down-regulation ti' le vías relacionadas yéetel OXPHOS yéetel le señalización calcio confirma le inducción disfunción mitocondrial ti' PNs deficientes ti' fusión, uláak' categorías ku implican chuunil laat'a'an metabolismo aminoácidos ku significativamente up-regulated, ba'ax táan ti' consonancia yéetel le metabolismo ku yúuchul ti' PN mitocondrial. U ka'a cableado jach consistente. ma' meyaj.
(A) Fotografías confocales representativas ti' jaatso'ob cerebellar ti' ch'o'obo' CTRL yéetel Mfn2cKO ku ye'esik asab progresiva ti' PNs (calbindin, gris); le núcleos bino'ob contrateñidos yéetel DAPI. (B) Cuantificación ti' (A) (análisis unidireccional ti' le varianza, ***P<0.001; n = 4 u 6 círculos u óoxp'éel ch'o'obo'). (C) Flujo meyaj experimental. (D) Distribución ti' le mapa ooxoj ti' le marcadores específicos ti' Purkinje (ka'anal) yéetel uláak' tipos células (chúumuk). (E) Diagrama u Venn ku ye'esik le meyaj ku proteínas mitocondriales identificadas ti' le PN clasificado. (F) Gráfico volcán u proteínas expresadas diferencialmente ti' neuronas Mfn2cKO ti' 8 semanas (je'o' corte significación u 1.3). (G) Le análisis bejil creatividad ye'esik le jo'op'éel asab importantes up-regulation (rojo) yéetel down-regulation (azul) vías ti' le Mfn2cKO PN clasificado bey 8 semanas. Ku ye'esik u chúumukil u expresión Amal proteína detectada. Mapa u ooxoj u escala u grises: je'o' P ajustado. ns, ma' k'a'anan.
Le datos proteómicos tu ye'eso'ob u le expresión proteína ti' le complejos I, III yéetel IV jujump'íitil disminuyó. Le complejos I, III yéetel IV tuláakal contenían subunidades codificadas tumen mtDNA k'a'abeto'ob, ka' jo'op' u le complejo II, ku bin chéen codificado tumen nuclear, bin básicamente ma' afectado (yoochel 2A yéetel yoochel S2A). . Je'el bix u ya'ala'al le proteómica, le inmunohistoquímica ti' le jaatso'ob u wa'ak'al cerebellar tu ye'esaj u le MTCO1 (mitocondrial citocromo C oxidasa subunidad 1) nivel subunidad complejo IV ti' PN jujump'íitil disminuyó (yoochel 2B). Le subunidad Mtatp8 codificada tumen mtDNA bin significativamente reducida (yoochel S2A), ka' jo'op' u le nivel estado estacionario ti' le subunidad ATP sintasa codificada tumen nuclear permaneció xma' cambios, ba'ax le consistente yéetel le k'ajóolta'an estable estable subensamblaje ATP sintasa F1 complejo ken u expresión mtDNA jach estable. Le formación jach consistente. Je'elel (7). U xak'alil u nivel mtDNA ti' le PNs Mfn2cKO clasificados tumen reacción ti' tsolokbal u polimerasa tu k'iinil xíimbal tumen (qPCR) confirmó le disminución gradual ti' le meyaj ku copias mtDNA. Ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal, ti' 8 semanas u ts'o'oka'an, chéen yan 20% ti' le nivel mtDNA bin retenido (yoochel 2C). Je'el bix le ba'ax ku yila'ala', le tinción tumen microscopía confocal ti' Mfn2cKO PNs uti'al u yila'al ADN ku ye'esik u jantbil le nucleótidos mitocondriales dependiente ti' le k'iino' (yoochel 2D). K encontramos u chéen yaan candidatos involucrados ti' le degradación proteína mitocondrial yéetel núukik estrés bino'ob up-regulated, incluyendo Lonp1, Afg3l2 yéetel Clpx, yéetel factores montaje complejo OXPHOS. Ma' ila'ak mix jump'éel cambio significativo ti' le niveles proteínas ku táakpajalo'ob ti' le apoptosis (yoochel S2B). Bey xan, k encontramos u le mitocondrias yéetel le canales retículo endoplásmico involucrados ti' le transporte calcio yaan chéen cambios menores (Figura S2C). Beyxan, le evaluación proteínas relacionadas yéetel le autofagia ma' tu kaxtaj cambios significativos, ba'ax le consistente yéetel le inducción visible ti' le autofagosomas observada in vivo tumen inmunohistoquímica yéetel microscopía electrónica (yoochel S3). Ba'ale', le disfunción progresiva OXPHOS ti' PNs ku láak'inta'al tumen cambios mitocondriales ultraestructurales obvios. Le racimos mitocondriales ku páajtal wil ti' le wíinkilal celulares yéetel le che'obo' dendríticas ti' Mfn2cKO PNs envejecidos 5 yéetel 8 semanas, yéetel le ba'ax membrana interior ts'o'ok u experimentado cambios profundos (Figura S4, A yéetel B). Je'el bix le k'eexo'ob ultraestructurales yéetel jump'éel disminución significativa ti' le mtDNA, análisis u rodajas cerebelo cerebral aguda yéetel éster metílico tetrametilrodamina (TMRM) tu ye'esaj u le potencial membrana mitocondrial ti' Mfn2cKO PNs bin significativamente disminuido (Figura S4C).
(A) Análisis u k'iinil le nivel expresión ti' le complejo OXPHOS. Chéen considerar proteínas yéetel P<0.05 ti' 8 semanas (ANOVA ka'ap'éel vías). Puntueado: Mina'an ajuste ti' comparación yéetel CTRL. (B) Izquierda: jump'éel ejemplo ti' jump'éel sección cerebelosa etiquetada yéetel anticuerpo anti-MTCO1 (barra de escala, 20 μm). Le kúuchil tu'ux yaan u wíinklil le células Purkinjeo' pixa'an tumen k'an. K'abil beya': Cuantificación u niveles MTCO1 (análisis unidireccional ti' le varianza; n = 7 u 20 células analizadas u óoxp'éel ch'o'obo'). (C) análisis qPCR u meyaj ku copia mtDNA ti' le PN clasificado (análisis unidireccional ti' le varianza; n = 3 u 7 ch'o'obo'). (D) Izquierda: jump'éel ejemplo ti' jump'éel rebanada cerebellar etiquetada yéetel juntúul anticuerpo anti-ADN (barra de escala, 20 μm). Le kúuchil tu'ux yaan u wíinklil le células Purkinjeo' pixa'an tumen k'an. K'abil beya': Cuantificación le lesiones mtDNA (análisis unidireccional ti' le varianza; n = 5 u 9 células u óoxp'éel ch'o'obo'). (E) jump'éel ejemplo ti' jump'éel sección cerebellar aguda ku ye'esik mitoYFP + células Purkinje (flecha) ti' jump'éel grabación abrazadera parche tuláakal célula. (F) Cuantificación ti' le curva IV. (G) Grabaciones representativas ti' le inyección sáasilo' despolarizante ti' células CTRL yéetel Mfn2cKO Purkinje. Rastro superior: Le yáax pulso ku desencadenó AP. Rastro inferior: Frecuencia AP máxima. (H) Cuantificación u entradas espontáneas postsinápticas (sPSPs). Le rastro grabación representativa yéetel u relación zoom ku muestran ti' (I). Análisis unidireccional ti' le varianza analizó n = 5 u 20 células u óoxp'éel ch'o'obo'. Le datos ku expresan bey promedio±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Rastros representativos u AP espontáneo registrado utilizando le modo abrazadera parche perforado. Rastro superior: Frecuencia AP máxima. Rastro inferior: zoom ti' jump'éel chéen AP. (K) Cuantificar le frecuencia AP chúumuk yéetel máxima bin (J). Mann-Whitney test; n = 5 células bino'ob analizadas ti' kantúul ch'o'obo'. Le datos ku expresan bey promedio±SEM; ma' k'a'anan.
Tu p'ataji' OXPHOS obvio bin detectado ti' le PN Mfn2cKO 8 semanas, indicando u le función fisiológica ti' le neuronas jach severamente anormal. Le o'olale', analizamos le características eléctricas pasivas ti' le neuronas deficientes ti' OXPHOS ti' 4 u 5 semanas yéetel 7 u 8 semanas yo'osal u realización grabaciones u abrazadera parche u células enteras ti' rodajas cerebellar aguda (yoochel 2E). Ma' u páa'ta'al, le potencial membrana descanso chúumuk yéetel le resistencia entrada ti' le neuronas Mfn2cKO bino'ob similares ti' le kaambalil yo'osal, kex yaan ka'ach diferencias sutiles ichil le células (tabla 1). Bey xan, ti' 4 u 5 semanas u ts'o'oka'an, ma' u encontraron cambios significativos ti' le relación sáasilo'-voltaje (curva IV) (yoochel 2F). Ba'ale', mix jump'éel neurona Mfn2cKO 7 u 8 semanas ts'o'oka'an sobrevivió le régimen IV (paso hiperpolarización), indicando u yaan jump'éel sensibilidad clara ti' le potencial hiperpolarización ti' le p'isibij final. U jela'anil, ti' le neuronas Mfn2cKO, le corrientes despolarizantes ku causan descargas potencial u acción repetitiva (AP) ku ma'alob toleradas, indicando u u patrones descarga global ma' le significativamente jela'an u le neuronas kanik 8 semanas (tabla 1 yéetel yoochel 2G). Bey xan, le frecuencia yéetel le amplitud le corrientes postsinápticas espontáneas (sPSCs) bino'ob comparables yéetel le ti' le múuch' kaambalil yo'osal, ka le frecuencia k'inbesajo'ob aumentó u 4 semanas u 5 semanas u 7 semanas u 8 semanas yéetel juntúul aumento similar (yoochel 2, H yéetel I). Le período u maduración sináptica ti' PNs (25). Ya'ala'al máaxo'ob máano'ob similares bino'ob obtenidos ka' parches PNs perforados. Le configuración je'el u páajtal u compensación le defectos ATP celulares, bey je'el u páajtal u yúuchul ti' le grabación abrazadera parche tuláakal le célula. Tu particular, le potencial membrana descanso yéetel frecuencia disparo espontáneo ti' le neuronas Mfn2cKO ma' bino'ob afectados (yoochel 2, J yéetel K). Ti' Resumen, le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob indican u PNs yéetel disfunción OXPHOS obvia páajtal u beetik yéetel patrones descarga ka'anal frecuencia ma'alob, indicando u yaan jump'éel mecanismo compensación ku cha'antik ti' leti'ob mantener respuestas electrofisiológicas naats'il u normales.
Le datos ku expresan bey promedio ± SEM (análisis unidireccional ti' le varianza, prueba comparación múltiple u Holm-Sidak; *P<0.05). Le meyaj ku unidad ku ye'esik ichil corchetes.
K jóok'ol k xak'altik wa je'el ba'ax categoría ti' le conjunto datos proteómica (yoochel 1G) analte'obo' yaan vías u páajtal u contrarrestar le deficiencia severa ti' OXPHOS, u tsool bey Ba'axten le PN afectado je'el u páajtal u mantener le electrofisiología naats'il u normal (yoochel 2, E u K). . Le análisis proteómico tu ye'esaj u le enzimas involucradas ti' le catabolismo aminoácidos u tsolokbal ramificada (BCAA) bino'ob significativamente up-regulated (yoochel 3A yéetel yoochel S5A), yéetel le producto final acetil-CoA (CoA) wa succinil CoA je'el u páajtal u complementar le tricarboxilatos ti' le ciclo ácido arteriosclerosis (TCA). K encontramos u le contenido BCAA transaminasa 1 (BCAT1) yéetel BCAT2 ambas aumentó. Catalizaron le yáax paso ti' le catabolismo BCAA tumen le generación glutamato ti' α-cetoglutarato (26). Tuláakal le subunidades ku beetiko'ob le complejo ceto ácido deshidrogenasa (BCKD) u tsolokbal ramificada ku regulan (le complejo cataliza le descarboxilación posterior yéetel irreversible ti' le esqueleto carbono BCAA resultante) (yoochel 3A yéetel figura S5A). Ba'ale', ma' encontraron cambios obvios ti' BCAA je'el wéet ti' le PN clasificado, ba'ax je'el u páajtal u debido a le aumento le absorción celular ti' le k'iino'oba' aminoácidos k'a'abeto'ob wa u búukinta'al uláak' fuentes (glucosa wa ácido láctico) utia'al u complementar le ciclo TCA (Figura S5B). PNs mina'an ti'ob OXPHOS xan mostraron aumento ti' le descomposición glutamina yéetel le meyajo'ob transaminación ti' 8 semanas u ts'o'oka'an, ku páajtal reflejar tumen le up-regulation ti' le enzimas mitocondriales glutaminasa (GLS) yéetel glutamina piruvato transaminasa 2 (GPT2) (Figura 3, jump'éel yéetel C). K'a'ana'an u ya'ala'ale' u le up-regulation GLS ku limita ti' le isoforma glutaminasa C empalmada (GLS-GAC) (le k'eexpajal Mfn2cKO leti' CTRL jach yan 4.5-fold, P = 0.05), yéetel u up-regulation específica ti' le tejidos cancerosos Je'el u páajtal u yáanta'al le bioenergía mitocondrial. (27).
(A) Le mapa ooxoj ye'esik le k'eexpajal pliegue ti' le nivel proteína utia'al u bejil especificada ti' 8 semanas. (B) Ejemplo ti' jump'éel rebanada cerebelosa etiquetada yéetel anticuerpo anti-PCx (barra de escala, 20 μm). Le flecha k'an ku chíikbesik u wíinkilal le célula Purkinje. (C) Análisis u expresión le proteínas u k'iinil identificado bey juntúul candidato Páaybe'en utia'al u aterosclerosis (t-test múltiple, *FDR <5%; n = 3-5 ch'o'obo'). (D) Tu yóok'ol: jump'éel diagrama esquemático ku ye'esik le jejeláas maneras u wokol ichil le carbono etiquetado contenido ti' le [1-13C] trazador piruvato (es decir, yo'osal PDH wa bejil trans-arterial). Inferior: Le cuadro violín ye'esik le porcentaje carbono chéen-etiquetado (M1) convertido ti' ácido aspártico, ácido cítrico yéetel ácido málico ka' etiquetar rodajas cerebellar aguda yéetel [1-13C] piruvato (prueba t emparejada; ** P <0.01). (E) Análisis integral ti' le k'ajláayo' k'iin ti' le bejo' indicado. Chéen considerar proteínas yéetel P<0.05 ti' 8 semanas. Internet ichil discontinua: mina'an u tojol ajuste (análisis u varianza ka'ap'éel vías; * P <0.05; *** P <0.001). Le datos ku expresan bey promedio±SEM.
Ti' k análisis, le catabolismo BCAA u ts'o'ok convertido ti' jump'éel le vías clave u up-regulation. Le ba'ala' sugiere fuertemente u le volumen ventilación ku yokol ti' le ciclo TCA je'el u páajtal u k'ex ti' PN carece u OXPHOS. Le je'ela' je'el u páajtal u representar jump'éel noj bejo' bix u recableado metabólico neuronal, ku páajtal yaantal jump'éel impacto Jun ti' le fisiología neuronal yéetel le supervivencia ichil le mantenimiento le disfunción severa OXPHOS. Je'el bix le hipótesis, k encontramos u le noj bejo' enzima antiaterosclerótica PCx táan up-regulated (Mfn2cKO leti' CTRL cambios yan 1.5 Óoxten; yoochel 3A), ku cataliza u yokol k'ujo'ob ti' le piruvato ti' oxaloacetato (28), ku u oksaj óoltik wa u ti' le tejidos cerebrales Le expresión astrocytes jach restringida (29, 30). Je'el bix u ya'alik le proteómica, le microscopía confocal tu ye'esaj u expresión PCx bin específicamente yéetel significativamente aumentada ti' PNs deficientes ti' OXPHOS, ka' jo'op' u reactividad PCx bin chuunil laat'a'an restringida ti' le células gliales Bergmann adyacentes ti' le kaambalil yo'osal (yoochel 3B). Utia'al u probar funcionalmente le upregulación observada ti' PCx, tratamos rodajas cerebellar agudas yéetel [1-13C] trazador piruvato. Le ken u piruvato bin oxidado tumen le piruvato deshidrogenasa (PDH), u etiqueta isótopo desapareció , Ba'ale' ku incorpora ti' le intermedios ciclo TCA ken u piruvato u metaboliza tumen reacciones vasculares (yoochel 3D). Utia'al u yáanta'al k datos proteómicos, observamos jump'éel nuxi' meyaj ku u marcadores ti' le trazador ti' le ácido aspártico ti' rodajas Mfn2cKO, ka' jo'op' u ácido cítrico yéetel ácido málico xan yaan ka'ach jump'éel tendencia moderada, kex ma' significativa (yoochel 3D).
Ti' le neuronas dopaminas ti' le ch'o'obo' MitoPark yéetel disfunción mitocondrial causada tumen le neuronas dopaminas específicamente destruyendo le gen factor transcripción mitocondrial jump'éel (Tfam) (Figura S6B), le expresión PCx xan bin significativamente up-regulated (31), indicando u arteriosclerosis ácido acetona Le ocurrencia le k'oja'anil jach regulada ichil le dysfunción neuronal OXPHOS ti' u wíinkilal. K'a'ana'an u ya'ala'ale' ts'o'ok u yila'al u enzimas únicas (32-34) ku páajtal expresar ti' neuronas ku páajtal u asociadas yéetel le arteriosclerosis ku significativamente up-regulated ti' PNs carecen ti' OXPHOS, bey propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA sutk'esiko'ob propionyl-CoA ti' maliconylconyl-Acondrial enzima 3 (ME3), cuyo ju'un noj bejo' jach u recuperar piruvato ti' le malato (yoochel 3, A yéetel C) (33, 35). Beyxan, k encontramos jump'éel aumento significativo ti' le enzima Pdk3, ku fosforila yéetel bey inactiva PDH (36), ka' jo'op' u ma' u detectaron cambios ti' le enzima Pdp1 ku activa PDH wa le complejo enzima PDH je'el wéet (yoochel 3A). Consistentemente, ti' Mern2cKO PNs, le fosforilación le subunidad α1 α (PDHE1α) subunidad le componente piruvato deshidrogenasa E1 ti' le complejo PDH ti' Ser293 (k'ajóolta'an tumen inhibir le actividad enzimática ti' PDH) bin mejorada ( Figura S6C) (Figura S6C). Le piruvato mina'an u muuk' vascular.
Tu ts'ooke', k encontramos u le super bejo' u biosíntesis serina yéetel glicina, le ciclo folato mitocondrial (1C) relacionado yéetel biosíntesis prolina (yoochel 1G yéetel yoochel S5C) tuláakal táan significativamente up-regulated, bin le informes, ichil le tuukula' activación. Le tejidos circundantes ku activan yéetel disfunción mitocondrial (5-7). Análisis confocal ku yáanta'al le k'iino'oba' datos proteómicos tu ye'esaj u ti' PN yéetel OXPHOS faltante, rodajas cerebellar u ch'o'obo' 8 semanas u ts'o'oka'an bino'ob sometidos ti' serina hidroximetiltransferasa 2 (SHMT2), jump'éel enzima clave ti' le ciclo folato mitocondrial. Núukik inmune significativa (yoochel S5D). Ti' 13 rodajas cerebellar aguda incubada yéetel CU-glucosa, experimentos u rastreo metabólico confirmaron asab le regulación superior ti' le biosíntesis serina yéetel prolina, indicando u le flujo isoformas carbono ti' serina yéetel prolina aumentó (yoochel S5E). Tuméen le reacciones promovidas tumen GLS yéetel GPT2 ku responsables ti' le síntesis glutamato ti' le glutamina yéetel le transaminación ichil glutamato yéetel α-cetoglutarato, u upregulación indica u le neuronas deficientes ti' OXPHOS yaan jump'éel asab demanda glutamato , Le je'ela' je'el u páajtal u dirigido ti' le mantener le asab biosíntesis proline (Figura S5). U jela'anil in le k'eexo'oba', jump'éel análisis proteómico ti' le astrocitos cerebelosos u ch'o'obo' Mfn2cKO específicos ti' PN tu ye'esaj u le k'iino'oba' vías (incluyendo tuláakal le antiperoxidasas) ma' k'ex significativamente ti' le expresión, demostrando bey Le redirección metabólica jach selectiva ti' le PN degradado (Fig. S6, D u G).
Ti' Resumen, le k'iino'oba' análisis revelaron patrones significativamente jejeláas u activación temporal u vías metabólicas específicas ti' PNs. Kex le función mitocondrial neuronal anormal je'el conducir ti' le aterosclerosis temprana yéetel le remodelación 1C (yoochel 3E yéetel yoochel S5C), ka páajtal cambios predecibles ti' le expresión complejos I yéetel IV, le cambios ti' le síntesis serina de novo ku chéen Chéen bin aparente ti' le p'isibij finales. OXPHOS disfunción (yoochel 3E yéetel yoochel S5C). Le ba'ax ku kaxta'ala' ku jets'ik jump'éel tuukula' secuencial tu'ux le núukik mitocondrial (ciclo 1C) yéetel citoplásmico (biosíntesis serina) inducido tumen estrés sinérgicamente yéetel le aumento ti' le aterosclerosis ti' le ciclo TCA utia'al u reestructurar le metabolismo neuronal.
8 semanas u OXPHOS-deficiente PNs páajtal mantener actividad excitación ka'anal frecuencia yéetel máan tumen reconexión metabólica significativa utia'al u compensar le disfunción mitocondrial. Le ba'ala' ku ts'áaik jump'éel jats'uts posibilidad u páajtal te' súutukila', le k'iino'oba' células xan páajtal k'amik intervención terapéutica utia'al u retrasar wa Je'e bix u páajtale' le neurodegeneración. Chúunk'in. K yutskíintik le je'ela' yéetel ka'ap'éel intervenciones independientes. Ti' le yáax método, diseñamos jump'éel vector virus adeno-asociado (AAV) dependiente u Cre utia'al u MFN2 je'el u páajtal u expresado selectivamente ti' PNs deficientes ti' OXPHOS in vivo (Figura S7A). Le AAV ku codifica MFN2 yéetel le gen reportero fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) bino'ob verificados ti' cultivos neuronas primarias in vitro, ku tu beetaj u MFN2 u expresado ti' jump'éel bix ken Cre-dependiente yéetel rescató le morfología mitocondrial, previniendo tune' le neuromutación ti' le neuronas Mfn2cKO ( Figura S7, D, D yéetel D). Tu láak', k meentik experimentos in vivo utia'al u k'ubik estereotácticamente Mfn2-AAV 8 semanas ti' le corteza cerebelosa ti' Mfn2cKO yéetel ch'o'obo' kanik, ka analizamos ch'o'obo' 12 semanas (yoochel 4A). Le ch'o'obo' Mfn2cKO tratados kíimo'ob (yoochel 1, A yéetel B) (16). Le transducción viral in vivo tu beetaj u yantal expresión selectiva ti' PN ti' yaan círculos cerebelosos (yoochel S7, G yéetel H). Le inyección ti' le AAV kaambalil yo'osal expresando chéen mCherry (Ctrl-AAV) ma' yaan ka'ach mix efecto significativo ti' le grado neurodegeneración ti' ba'alche'ob Mfn2cKO. U jela'anil, le análisis Mfn2cKOs transducidos yéetel Mfn2-AAV tu ye'esaj jump'éel efecto protector significativo ti' le capa celular PN (yoochel 4, B yéetel C). Tu particular, le densidad neuronas bey u óol indistinguible ti' le ba'alche'obo' kanik (yoochel 4, B yéetel C, yéetel yoochel S7, H yéetel I). Le expresión MFN1 ba'ale' ma' MFN2 jach igualmente xoknáalo'obo' ti' le salvar u kíimile' neuronal (yoochel 4C yéetel yoochel S7, C yéetel F), ku indica u le expresión MFN1 ectópico je'el u páajtal u complementar yéetel eficacia le si'ipil MFN2. Uláak' análisis ti' le nivel PN chen tu ye'esaj u Mfn2-AAV tu gran medida rescató le ultraestructura le mitocondrias, normalizó le niveles mtDNA, ka invertido le ka'anal expresión le marcador anti-angiogénesis PCx (Figura 4, C u E ). Inspección visual ti' le ch'o'obo' Mfn2cKO rescatados ti' jump'éel noj descanso tu ye'esaj u u postura yéetel síntomas motores (movimiento S1 u S3) bino'ob mejorados. Tu ts'ooke', le k'iino'oba' experimentos muestran u reintroducción retrasada u MFN2 ti' PNs severamente deficientes ti' OXPHOS jach suficiente utia'al u revertir le jant p'áatalij mtDNA yéetel inducir le aterosclerosis, previniendo tune' le degeneración axón yéetel u kíimile' neuronal in vivo.
(A) jump'éel esquema ku ye'esik le k'iinil experimental uti'al u inyectar AAV codificando MFN2 ken u activa le bejo' metabólico indicado. (B) Fotografías confocales representativas u jaatso'ob cerebellar 12 semanas transducidas yéetel ch'o'obo' Mfn2cKO ti' 8 semanas yéetel etiquetadas yéetel anticuerpo anti-Calbindin. K'abil beya': Escala ti' le fibras axón. U nojchil le zoom axón jach 450 yéetel 75 μm. (C) Izquierda: Cuantificación u densidad le células Purkinje ti' le bucle transducción AAV (AAV +) (análisis unidireccional ti' le varianza; n = 3 ch'o'obo'). K'abil beya': análisis enfoque mtDNA ti' PN transducido ti' le semana 12 (prueba t ma' emparejada; n = 6 células u óoxp'éel ch'o'obo'). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Micrografías electrónicas u transmisión representativas u PNs u jaatso'ob cerebelosas Mfn2cKO transducidas yéetel le vectores virales indicados. Le máscara rosa ku ye'esik le kúuchil ocupado tumen le dendritas, yéetel le cuadrado punteado k'an ku ye'esik le zoom proporcionado ti' le derecha; n ku chíikbesik le núcleo. Barra de escala, 1μm. (E) ye'esik jump'éel ejemplo u tinción PCx ti' PN transducido ti' 12 semanas. Barra de escala, 20μm. OE, sobreexpresión; FC, k'eexpajal u doblar.
Tu ts'ooke', investigamos u k'a'ana'anil le supervivencia celular inducida tumen le peroxidasa ti' PNs ku séen experimentado disfunción OXPHOS. K generamos mCherry codificando AAV-shRNA (ARN horquilla corta) específicamente dirigido u mRNA PCx ch'o' (AAV-shPCx), ka inyectamos le virus wa u kaambalil yo'osal revuelto (AAV-scr) ti' le cerebelo ch'o'obo' Mfn2cKO. Le inyección bin u realizada ti' le cuarta semana u ts'o'oka'an (yoochel 5A) utia'al u kaxta'al u yúuchul xoknáalo'obo' PCx knockdown ichil le período tu'ux aumentó le expresión PCx (yoochel 3C) yéetel le capa celular PN láayli' ka'ach intacta (yoochel 1A). K'a'ana'an u ya'ala'ale' u k'a'alal PCx (yoochel S8A) ku bisik ti' jump'éel aceleración significativa ti' u kíimile' PN, ba'ax le le chen ts'ipit k'ab restringido ti' le infección (yoochel 5, B yéetel C). Utia'al u entender le mecanismo le táanil metabólicos inducidos tumen PCx up-regulation, estudiamos le noj redox ti' PNs ka' PCx knockdown yéetel biosensor óptico mediado tumen AAV Grx1-roGFP2 bino'ob expresados ​​simultáneamente (yoochel S8, B u D) utia'al u evaluar le glutatión Le k'eexpajal relativo ti' le potencial péptido redox (883). Tu láak', k meentik jump'éel microscopía u imagen u fluorescencia u ka'ap'éel fotones (FLIM) ti' rodajas agudas u ta ts'o'omej Mfn2cKO 7 semanas wa kanik littermates utia'al u detectar cambios potenciales ti' le noj redox citoplasmático ka' verificar condiciones FLIM (Figura S8, E u G). Le análisis tu ye'esaj jump'éel aumento significativo ti' le noj oxidación jump'éel chéen Mfn2cKO PNs carece u expresión PCx, ba'ax le jela'an u neuronas kanik wa Mfn2cKO PNs expresando chéen shRNA revuelto (yoochel 5, D yéetel E). Le ken u expresión PCx bin u down-regulated, le porcentaje Mfn2cKO PNs ye'esik jump'éel noj jach oxidado aumentó tumen asab u óoxp'éel Óoxten (yoochel 5E), indicando u PCx up-regulation mantiene le Buka'aj u ba'al u redox le neuronas degeneradas.
(A) jump'éel esquema ku ye'esik le k'iinil experimental uti'al u inyectar AAV codificando shPCx ken u activa le bejo' metabólico indicado. (B) Fotografías confocales representativas u jaatso'ob cerebellar 8 semanas ti' ch'o'obo' Mfn2cKO transducidos yéetel etiquetados yéetel anticuerpo anti-calcineurina ti' 4 semanas. Barra de escala, 450μm. (C) Cuantificación u densidad le células Purkinje ti' bucles transducidos tumen AAV (análisis unidireccional ti' le varianza; n = 3 u 4 ch'o'obo'). Le datos ku expresan bey promedio±SEM; ***P<0.001. (D) U yoochel FLIM representativo ku ye'esik u kuxtal chúumuk u 7 semanas u PN expresando sensor redox glutatión Grx1-roGFP2 yáanal le condiciones experimentales especificadas. LUT (look-up table) ratio: intervalo u k'iinil supervivencia (ti' picosegundos). Barra de escala, 25μm. (E) Le histograma ku ye'esik u t'o'oxol u tojol kuxtal Grx1-roGFP2 u (D) (n = 158 u 368 células ti' ka'ap'éel ch'o'obo' yáanal Amal condición). Le cuadro pastel yóok'ol Amal histograma: ye'esik le meyaj ku células yéetel significativamente asab chowaktako'ob (rojo, oxidado) wa asab kóom (azul, reducido) valores kuxtal útil, ku superan 1 SD ti' le je'o' promedio kuxtal útil ti' CTRL-AAV-scr. (F) Le bix u propuesto ye'esik le efecto protector ti' le upregulación u PCx neuronal.
Tuláakal, le datos k ts'aik waye' muestran u le reexpresión MFN2 je'el u páajtal u salvar completamente PN avanzado yéetel deficiencia OXPHOS severa, agotamiento mtDNA severo, yéetel morfología extremadamente anormal bey ista, proporcionando tune' progreso continuo páajtal ti' k'aas k'oja'anilo'obo' avanzadas. Le neurodegeneración ku ts'aik evidencia reversible ti' le p'isibij bey ma' u kíimile' le célula. Le grado flexibilidad metabólica ku enfatiza asab tumen le Buka'aj u ba'al u neuronas utia'al u inducir le aterosclerosis (jump'éel recableado ti' le ciclo TCA), ku inhibe le expresión PCx ti' PNs carecen ti' OXPHOS yéetel mejora u kíimile' le células, báaxal tune' jump'éel ju'un protector (yoochel 5F).
Te' xook je'ela', k ts'áaj evidencia ti' le núukik PNs ti' le disfunción OXPHOS jach u convergir jujump'íitil ti' le aterosclerosis ciclo TCA yo'osal le bejo' activación diferencial activada tumen programas metabólicos. Confirmamos le análisis proteómico yéetel ya'ab métodos complementarios yéetel revelamos u ken u desafian tumen disfunción mitocondrial severa, le neuronas yaan ti' jump'éel bix u elasticidad metabólica desconocida ka'ache'. Utia'al k sorpresa, tuláakal le tuukula' recableado ma' necesariamente marca le noj metabólico terminal ku acompaña le neurodegeneración jujump'íitil yéetel irreversiblemente, ba'ale' k datos sugieren u je'el constituir jump'éel neurona mantenimiento páajtal ti' le p'isibij bey ma' u kíimile' le célula Mecanismo compensación funcional. Le ba'ax ku kaxta'ala' ku ye'esik le neuronaso'obo' yaan ti'ob jump'éel grado considerable ti' plasticidad metabólica ti' u wíinkilal. Le je'ela' ku ye'esik u le reintroducción posterior ti' MFN2 je'el u páajtal u revertir le expresión marcadores metabólicos clave yéetel Je'e bix u páajtale' le degeneración PN. Tu contrario, ku inhibe le aterosclerosis yéetel ku acelerar le nervios. transexual.
Juntúul le hallazgos asab fascinantes ti' k investigación jach u PNs carecen ti' OXPHOS páajtal modificar le metabolismo ciclo TCA tumen up-regulating enzimas ku estimulan específicamente le arteriosclerosis. Le reorganización metabólica jach jump'éel característica común ti' le células cancerosas, yane' ti' le ku dependen ti' le glutamina utia'al u complementar le intermedios ciclo TCA utia'al u producir equivalentes reductores, ku conducen le tsolokbal respiratoria yéetel mantener le producción precursores biosíntesis lípidos yéetel nucleótidos (39 , 40). jump'éel xook ts'oonak tu ye'esaj ti' le tejidos periféricos ku experimentan disfunción OXPHOS, le reconexión metabolismo glutamina leti' glutamato xan jach jump'éel característica prominente (5, 41), tu'ux le dirección le entrada glutamina ti' le ciclo TCA yaantal yo'osal u Tuméen le gravedad le loobo' OXPHOS (41). ). Ba'ale', mina'an jump'éel evidencia chika'an yóok'ol je'el ba'ax similitud ti' le plasticidad metabólica neuronal ti' u wíinkilal yéetel u páajtal relevancia ti' le contexto le k'oja'anil. Ti' jump'éel xook in vitro ts'oonak, le neuronas corticales primarias ku ye'esik u movilizar le piscinas glutamato utia'al u neurotransmisión, promoviendo bey le metabolismo oxidativo yéetel le aterosclerosis yáanal condiciones estrés metabólico (42). K'a'ana'an u ya'ala'ale' yáanal le inhibición farmacológica ti' le enzima ciclo TCA succinato deshidrogenasa, u oksaj óoltik wa u carboxilación piruvato mantener le síntesis oxaloacetato ti' neuronas gránulo cerebeloso cultivado (34). Ba'ale', le relevancia fisiológica ti' le k'iino'oba' mecanismos ti' u wa'ak'al cerebral (tu'ux u oksaj óoltik wa u aterosclerosis u confinada chuunil laat'a'an ti' le astrocitos) láayli' yaan jump'éel significado fisiológico Páaybe'en (43). Te' súutuka', k datos muestran u PNs dañados tumen OXPHOS ti' u wíinkilal páajtal k'ex u degradación BCAA yéetel carboxilación piruvato, ku le ka'ap'éel fuentes k'ajle' u suplementación le intermedios piscina TCA. Kex u ts'o'ok u propuesto le contribución putativa ti' le catabolismo BCAA ti' le metabolismo energía neuronal, Beyxan ti' kaambalilo'ob le ju'uno' le glutamato yéetel GABA utia'al u neurotransmisión (44), láayli' mina'an mix jump'éel prueba utia'al le k'iino'oba' mecanismos in vivo. Le o'olale', chéen ch'a'abil u especular u PNs disfuncionales páajtal compensar automáticamente le jant p'áatalij intermedios TCA impulsados ​​tumen le tuukula' asimilación tumen aumento le aterosclerosis. Tu particular, u regulación u PCx je'el u páajtal u k'a'abeto'ob utia'al u mantener jump'éel asab demanda ácido aspártico, ku ts'o'ok demostrado ti' células proliferantes yéetel disfunción mitocondrial (45). Ba'ale', k análisis metabolómico ma' tu ye'esaj mix jump'éel cambio significativo ti' le nivel estado estacionario ti' le ácido aspártico ti' Mfn2cKO PNs (yoochel S6A), ku presumiblemente refleja le utilización metabólica jela'an u ácido aspártico ichil le células proliferantes yéetel le neuronas post-mitóticas. Kex le mecanismo exacto ti' le regulación PCx ti' le neuronas disfuncionales in vivo sigue siendo utia'al u caracterizar, demostramos u le núukik prematura desempeña jump'éel ju'un Páaybe'en ti' le mantenimiento le noj redox ti' le neuronas, ku bin demostrado ti' experimentos FLIM ti' rodajas cerebellar. Tu particular, Je'e bix u páajtale' u PNs u up-regulating PCx je'el conducir ti' jump'éel noj asab oxidado yéetel acelerar u kíimile' le células. Le activación ti' le degradación BCAA yéetel le carboxilación ti' le piruvato ma' le maneras u caracterizar le tejidos periféricos ti' le disfunción mitocondrial (7). Le o'olale', ku yila'al bey jump'éel característica prioritaria ti' le neuronas deficientes ti' OXPHOS, páajtal wa ma' le chen característica, ba'ax le Páaybe'en utia'al u neurodegeneración. .
Le k'oja'anil cerebellar jach jump'éel bin yano'ob k'oja'anil neurodegenerativa heterogénea ku chíikpajal bey ataxia yéetel tu menudo daña PNs (46). Le múuch' neurona'oba' jach vulnerable ti' le disfunción mitocondrial tuméen u degeneración selectiva ti' le ch'o'obo' jach suficiente utia'al u reproducir ya'ab ti' le síntomas motores ku caracterizan le ataxia espinocerebellar humana (16, 47, 48). Je'el bix u ya'alik le informe'obo', jump'éel bix u ch'o' transgénico yéetel juntúul gen mutante ku asocia yéetel le ataxia espinocerebellar humana yéetel yaan disfunción mitocondrial (49, 50), enfatizando u k'a'ana'anil u xook le consecuencias le deficiencia OXPHOS ti' PNPH. Le o'olale', jach particularmente adecuado utia'al u aislar yéetel xook yéetel eficacia le jo'olkaajo' neurona chen. Ba'ale', ts'áaik u PNs le jach sensibles ti' le presión yéetel representan jump'éel baja proporción ti' tuláakal le jo'olkaajo' células cerebelosas, utia'al ya'ab xook basados ​​ti' omics, separación selectiva ti' leti'ob bey células enteras láayli' leti' jump'éel aspecto desafiante. Kex óol imposible u kaxta'al u yúuchul si'ipil absoluta u contaminación uláak' tipos celulares (especialmente tejidos adultos), combinamos jump'éel paso disociación xoknáalo'obo' yéetel FACS utia'al u kéen p'áatak jump'éel meyaj ku suficiente u neuronas viables utia'al u análisis proteómico aguas abajo, ka yaantal bastante ka'anal cobertura proteína (yan 3000 proteínas) ti' comparación yéetel le datos existentes ti' le conjunto cerebelo tuláakal (15). Utia'al u kanáanta'al u kuxtal le células enteras, le método k ts'aik waye' ku cha'antik ma' chéen k wilik le cambios ti' le vías metabólicas ti' le mitocondrias, sino xan k wilik le cambios ti' u contrapartes citoplasmáticas, ku complementa u búukinta'al le enriquecimiento etiqueta membrana mitocondrial específico ti' le tipos celulares Le túumben método utia'al u meyaj ku complejos mitocondrias ti' le tejido (255, 25). Le método k tsolik ma' chéen yaan ba'al u yil yéetel u xookil le células Purkinje, ba'ale' je'el u páajtal u aplicar uchik ti' je'el bin yano'ob célula utia'al u abordar le cambios metabólicos ti' le cerebros k'oja'ano'ob, incluyendo uláak' modelos u disfunción mitocondrial.
Tu ts'ooke', ts'o'ok k identificado jump'éel ventana terapéutica ichil le tuukula' reorganización metabólica u páajtal u jaatsatako'ob revertir le signos clave ti' le estrés celular yéetel Je'e bix u páajtale' le degeneración neuronal. Le o'olale', u na'atik le implicaciones funcionales ti' le recableado descrito waye' je'el u páajtal u ts'aik tuukulil fundamentales ti' posibles tratamientos utia'al u mantener le viabilidad neuronal ichil le disfunción mitocondrial. K'a'abéet u xak'alta'al le cambios ti' le metabolismo energético ti' uláak' tipos células cerebrales utia'al u revelar plenamente le aplicabilidad ti' le principio ti' uláak' k'aas k'oja'anilo'obo' neurológicas.
Ch'o'obo' MitoPark séen sido descritos ka'ache' (31). Ch'o'obo' C57BL leti' 6N yéetel loxP flanqueando Mfn2 genes séen sido descritos ka'ache' (18) yéetel cruzados yéetel ch'o'obo' L7-Cre (23). Le progenie heterocigota doble resultante bin túun cruzada yéetel ch'o'obo' homocigotos Mfn2loxP leti' Mfn2loxP utia'al u generar knockouts genéticos específicos u Purkinje utia'al u Mfn2 (Mfn2loxP leti' Mfn2loxP; L7-cre). Ti' jump'éel subconjunto u acoplamiento, le alelo Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) bin introducido yo'osal cruzamientos adicionales (20). Tuláakal le procedimientos ba'alche'obo' u realizaron de acuerdo con le directrices europeas, nacionales yéetel institucionales yéetel aprobados tumen LandesamtfürNatur u Umwelt yéetel Verbraucherschutz, Rin del Norte-Westfalia, Alemania. Meyaj ti' ba'alche'ob xan bin u náakake' u yaak'il le Federación Europea ti' Asociaciones u Ciencias Animales u Laboratorio.
Ka' ts'o'ok u anestesiar le luxación cervical ti' le ko'olelo' embarazada, le embrión ch'o' ku aisla (E13). Le corteza bin disecada ti' le solución ta'ab equilibrada u Hanks (HBSS) complementada yéetel 10 mM Hepes yéetel máan ti' Dulbecco's Modified Eagle's Medium ku taasik papaína (20 U leti' ml) yéetel cisteína (1μg leti' ml). Incuba le wa'ak'al ti' DMEM) yéetel disociar tumen digestión enzimática. Ml) ti' 37°C ichil 20 minutos, ka tu láak' mecánicamente fresado ti' DMEM complementado yéetel 10% suero bovino fetal. Le células bino'ob u sembradas ti' coverslips vidrio recubiertos yéetel polilisina ti' jump'éel densidad 2 × 106 tumen 6 cm plato miatsil wa ti' jump'éel densidad 0.5 × 105 células leti' cm2 utia'al u análisis u imágenes. Ka' 4 horas, le chúumuk bin reemplazado yéetel chúumuk Neurobasal libre u suero ku taasik 1 ti chúumuk suplemento B27 yéetel 0.5 mM GlutaMax. Le neuronas bino'ob túun mantenidas ti' 37°C yéetel 5% CO2 ichil le experimento, ka alimentadas juntéene' ti' le semana. Utia'al u inducir le recombinación in vitro, 3μl (24-well culture dish) wa 0.5μl (24-well plate) ti' le je'ela' vector virus AAV9 bin utilizado utia'al u k'aax u neuronas ti' le ka' k'iin in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, meyaj ku catálogo 105530-AAV9) yéetel AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, meyaj ku catálogo 105545-AAV9).
Ch'o' Mfn1 yéetel Mfn2 ADN complementario (obtenido ti' le plásmido Addgene #23212 yéetel #23213, respectivamente) ku marcan yéetel le secuencia V5 (GKPIPNPLLGLDST) ti' le C-terminus, ka ku fusionan yéetel mCherry ti' marco yo'osal le secuencia T2A. Grx1-roGFP2 jump'éel siibal ti' Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Utia'al u k'e'exel le casete tdTomato yéetel métodos clonación convencionales, le casete bin subclonada ti' le columna vertebral pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (meyaj ku referencia u Addgene 28306) utia'al u generar pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 yéetel pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vectores. Utia'al u beeta'al le vector kanik pAAV-CAG-FLEX-mCherry, meyajnaj jump'éel estrategia bey je'ex lela'. Utia'al u beeta'al le construcción AAV-shPCx, k'a'abéet jump'éel vector AAV plásmido (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), ku taasik le secuencia ADN ku codifica le shRNA ku ch'a'iko'ob PCx ti' le ch'o'o' (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAAGGACTACTAGACTAG 3′) Yáanal u kanik le promotor U6, mCherry ku meyajtiko'ob yáanal u kanik le promotor CMV. U beeta'al vectores AAV auxiliares beeta'ab je'el bix u ya'alik le fabricanteo' (Cell Biolabs). Tu kóom t'aan, meyaj juntúul plásmido transferencia ku bisik mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transitoriamente Transfección u células 29AV-MFN2-V5-N2-AV5 mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) wa Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gen codificador, bey xan codificando proteína cápside AAV1 yéetel proteína accesoria plásmido plásmido embalaje, utilizando método fosfato calcio. Le sobrenadante virus crudo bin u obtenido tumen ciclos congelación-descongelación ti' jump'éel wichkíil hielo tikin leti' etanol yéetel células lisadas ti' solución salina tamponada yéetel fosfato (PBS). Le vector AAV bin purificado tumen ultracentrifugación discontinua u gradiente iodixanol (24 horas ti' 32.000 rpm yéetel 4 ° C) yéetel concentrado utilizando jump'éel filtro centrífugo ultra-15 Amicon. Título u genoma u AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 copia u genoma (GC) leti' ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC leti' ml), AAV1-CAG-FLEX bin bey descrito ka'ache' (dd tu k'iinil xíimbal tumen cuantitativo tumen PCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC leti' ml) yéetel AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC leti' ml).
Le neuronas primarias bino'ob raspadas ti' 1x PBS síis bey hielo, pelletizadas, ka tu láak' homogeneizadas ti' 0.5% Triton X-100 leti' 0.5% desoxicolato sodio leti' PBS tampón lisis ku taasik fosfatasa yéetel inhibidor proteasa (Roche). U p'iis le proteínao' beeta'ab yéetel u meyaj le ensayo ti' ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific). Le proteínas bino'ob túun separadas tumen electroforesis ti' gel SDS-poliacrilamida, ka tu láak' blotted ti' jump'éel membrana fluoruro polivinilideno (GE Healthcare). Bloquear le kúuchilo'ob ma' específicos yéetel incuba yéetel le anticuerpo primario (wil cuadro S1 utia'al u detalles) ti' 5 ti chúumuk yiim ti' TBST (Tris-tamponada salina yéetel Tween), wook p'o' yéetel anticuerpo p'iskaambal ti' TBST Incuba. Incuba yéetel anticuerpo primario ichil áak'ab ti' +4°C. Ka' ts'o'okok u p'o'ik, ts'áa le anticuerpo p'iskaambal ichil 2 horas ti' temperatura ambiente. Ka' ts'o'oke', tumen incubar le bak'paach mancha yéetel juntúul anticuerpo anti-β-actina, u confirmado le bak'paach kuuch. Detección tumen sutk'esiko'ob ti' quimioluminiscencia yéetel ma'alo'obkíinsiko'ob le quimioluminiscencia (GE Healthcare).
Le neuronas ka'ache' sembradas ti' coverslips vidrio bino'ob fijadas yéetel 4 ti chúumuk paraformaldehído (PFA) leti' PBS ti' le ch'aaj k'iin especificado ti' temperatura ambiente ichil 10 minutos. Le coverslips ku yáax permean yéetel 0.1% Triton X-100 leti' PBS ichil 5 minutos u temperatura ambiente, ka tu láak' ti' tampón bloqueo [3% albúmina sérica bovina (BSA) leti' PBS]. Tu ka' k'iinil, le coverslips bino'ob lavados yéetel tampón bloqueo yéetel incubados yéetel le anticuerpo p'iskaambal conjugado yéetel fluoróforo apropiado ichil 2 horas u temperatura ambiente; tu ts'ooke', le muestras bino'ob lavadas ma'alob ti' PBS yéetel 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) jach contrateñido ka tu láak' fijado ti' le diapositiva microscopio yéetel Aqua-Poly leti' Mount.
Ch'o'obo' (xiibo'ob yéetel ko'olelo'ob) bino'ob anestesiados tumen inyección intraperitoneal ti' ketamina (130 mg leti' kg) yéetel xilazina (10 mg leti' kg) yéetel administrados subcutáneamente yéetel analgésico carprofeno (5 mg leti' kg) , ka colocados ti' jump'éel instrumento estereotáctico (Kopf) equipado yéetel juntúul warm. Exponer le cráneo yéetel meyaj juntúul taladro dental utia'al u bek'echtal le nu'ukulil le corteza cerebelosa correspondiente ti' le baako' mis (u lambda: u nej 1.8, lateral 1, correspondiente ti' le lóbulos IV yéetel V). Meyaj juntúul aguja jeringa curva utia'al u crear cuidadosamente jump'éel chan jool ti' le cráneo utia'al Jech interrumpir le vasculatura yáanal. Tu láak' le capilar vidrio bek'ech dibujado ku inserta Chaambel ti' le micro-orificio (u -1.3 u -1 ti' le tséel ventral ti' le dura mater), ka 200 u 300 nl AAV ku inyecta ti' le micro-inyector (Narishige) yéetel jeringas manuales (Narishige) ya'abkach Óoxten ti' baja presión ti' jump'éel período k'iin u 20 minutos u ventanas. Le ken ts'o'okok le infusióno', ts'áa le capilar ichil uláak' 10 minutos uti'al u páajtal u k'i'itpajal le viruso'. Le ken ts'o'okok u jóok'sa'al le capilares, u yoot'el ku sutura cuidadosamente utia'al u minimizar le inflamación herida yéetel permitir ti' le ba'alche'o' recuperar. Le ba'alche'obo' bino'ob tratados yéetel analgésicos (caspofeno) ichil ya'ab k'iino'ob ka' le operación, ichil le k'iin u condición física bin cuidadosamente monitoreada ka tu láak' bino'ob eutanasiados ti' le ch'aaj k'iin declarado. Tuláakal le meyajo'ob beeta'abo'ob je'el bix u ya'alik le directrices europeas, nacionales yéetel institucionales yéetel bino'ob aprobados tumen LandesamtfürNatur u Umwelt yéetel Verbraucherschutz, Rin del Norte-Westfalia, Alemania.
Le ba'alche'obo' bino'ob anestesiados yéetel ketamina (100 mg leti' kg) yéetel xilazina (10 mg leti' kg), ka u puksi'ik'al bin perfundido yéetel 0.1 M PBS yáax, ka tu láak' yéetel 4 ti chúumuk PFA ti' PBS. Le wa'ak'al bin disecado yéetel fijado ti' 4 ti chúumuk PFA leti' PBS ichil áak'ab ti' 4 ° c. Juntúul cuchillo vibrador (Leica Microsystems GmbH, Viena, Austria) bin utilizado utia'al u preparar jaatso'ob sagital (50 μm espesor) ti' le ta ts'o'omej fijo ti' PBS. Wa ma' u ya'ala'al uláak' bix ken, u tinción le jaatso'ob libres flotantes u realizó bey descrito ka'anal (13) u temperatura ambiente yéetel agitación. Tu ke, yáax, le rodajas obtenidas bino'ob permeabilizadas yéetel 0.5 ti chúumuk Triton X-100 leti' PBS ichil 15 minutos u temperatura ambiente; uti'al yaan epítopos (Pcx yéetel Shmt2), tumen ti' tampón tris-EDTA ti' 80°C (PH 9) k'íintik le rodajas ichil 25 minutos kúuchil le paso. Tu láak', le jaatso'ob bino'ob incubadas yéetel anticuerpo primario (wil cuadro S1) ti' tampón bloqueo (3 ti chúumuk BSA leti' PBS) ti' 4 ° c ichil áak'ab yéetel agitación. Tu láak' k'iin, le jaatso'obo' bino'ob lavadas yéetel tampón bloqueo yéetel incubadas yéetel le anticuerpo p'iskaambal conjugado yéetel fluoróforo apropiado ichil 2 horas u temperatura ambiente; tu ts'ooke', le jaatso'obo' bino'ob lavadas ma'alob ti' PBS, contrateñidas yéetel DAPI, ka tu láak' fijadas yéetel AquaPolymount Ti' jump'éel diapositiva microscopio.
Utia'al u yoochel le muestrao' meyajnaj jump'éel microscopio confocal u exploración láser (TCS SP8-X wa TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) equipado yéetel juntúul láser sáasil sak yéetel juntúul láser ultravioleta 405 diodo. Ikil u péek le fluoróforo yéetel u much'ik le señal yéetel le detector híbrido (HyDs), software LAS-X bin utilizado utia'al u recoger máak apiladas conformes ti' le muestreo Nyquist ti' modo secuencial: utia'al u paneles ma' cuantitativos, jach señales jach dinámicas (je'ebix, ti' células somáticas yéetel dendritas) mtY U FPD utia'al u detectar Hybrid meyaj ku ti' le derecha BPNRs modo). Utia'al u xu'ulul u ju'unil tu'ux yaan, ku meyaj jump'éel gating 0.3 tak 6 ns.
Imágenes tu k'iinil xíimbal tumen u células clasificadas. Ka' ts'o'ok u clasificar ti' chúumuk Neurobasal-A ku taasik 1% suplemento B27 yéetel 0.5 mM GlutaMax, le células bino'ob inmediatamente sembradas ti' diapositivas vidrio recubiertas u poli-l-lisina (μ-Slide8 Ma'alob, Ibidi, meyaj ku catálogo 80826) , ka tu láak' mantener ti' 37°C yéetel 12% utia'al u permitir le célula jets'tal. Le imagen tu k'iinil xíimbal tumen u realizado ti' jump'éel microscopio confocal u exploración láser Leica SP8 equipado yéetel juntúul láser sak, HyD, 63 × [1.4 apertura numérica (NA)] lente objetivo u k'aab tsaats yéetel juntúul p'isibij calefacción.
Le ch'o'o' jáan bin anestesiado yéetel dióxido carbono yéetel decapitado, u ta ts'o'omej bin jáan retirado ti' le cráneo, ka ch'ak ti' 200μm espesor (uti'al u experimento etiquetado 13C) wa 275μm espesor (uti'al u experimentos ka'ap'éel fotón) sección sagital Chuup yéetel le je'ela' materiales Le helado (HM-605, VHerific, The Scientific Walldorf, Alemania) Chuup yéetel le je'ela' sustancias: 125 mM hielo-frío, saturado yéetel carbono (95% O2 yéetel 5% CO2) t'okik Ca2 + líquido cerebroespinal artificial (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón fosfato sodio, 2.5 mM, mM CO2, glusa 0.5 mM CaCl2 yéetel 3.5 mM MgCl2 (presión osmótica u 310 u 330 mmol). Transferir le rodajas u ta ts'o'omej obtenidas ti' jump'éel cámara preincubación ku taasik asab Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón fosfato sodio, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucosa, 10 mM yéetel 20 mM Ca MgCl2) chúumuk) pH 7.4 yéetel 310 u 320 mmol).
ichil le tuukula' imagen, le rodajas bino'ob u péeksa'al ti' jump'éel sala u imagen dedicada, ka le experimento bin u realizado yáanal perfusión continua ACSF ti' jump'éel temperatura constante u 32 ° u 33 ° c. Utia'al u ch'a'abal u yoochel le rebanadao' meyajnaj jump'éel microscopio u exploración láser multifotón (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) equipado yéetel juntúul lente objetivo Leica 25x (NA 0.95, ja'), Ti: Sapphire láser (Chameleon Vision II, Coherent). Módulo FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM ti' Grx1-roGFP2. Le cambios ti' le noj redox citoplasmático ti' le PNs bino'ob medidos tumen FLIM ka'ap'éel fotones ti' rodajas u ta ts'o'omej sagital, tu'ux le biosensor Grx1-roGFP2 dirigió PNs. Ti' le capa PN, le sikte adquisición ku selecciona yan 50 u 80 μm yáanal le superficie le rebanada utia'al u asegurar ti' u yaan jump'éel PN viable (es decir, le si'ipil ba'ax cuentas wa cambios morfológicos neuronales a lo largo de le dendritas) yéetel le sensor roGFP2 doble positivo yéetel AAV codificando shRNA PCx wa u secuencia kaambalil yo'osal coexpresión (cada coexpresión mCherry). Mool máak ti' jump'éel chéen pila yéetel 2 x zoom digital [longitud onda excitación: 890 nm; 512 nm 512 píxeles]. Detección: HyD interno, múuch' filtro isotiocianato fluoresceína (FITC)] yéetel wíimbala' promedio ichil 2 u 3 minutos ku utilizan utia'al u asegurar u u recogen suficientes fotones (1000 fotones ti' total) utia'al u ajuste le curva. Le sensibilidad ti' le sonda Grx1-roGFP2 yéetel le verificación condiciones FLIM u realizaron tumen monitoreo le je'o' kuxtal útil ti' roGFP2 ti' le añadir exógeno 10 mM H2O2 ti' le perfusión ACSF (utia'al u maximizar le oxidación, ts'áaik tumen resultado aumento ti' kuxtal útil), ka tu láak' añadir 2 mM ditiothreit (disminuir le grados reducción ti' jump'éel resultado u yéemel u kuxtal) (Yoochel S8, D tak G). Meyaj software FLIMfit 5.1.1 utia'al u analizar ya'ala'al máaxo'ob máano'ob adquiridos, ajuste le curva desintegración exponencial chen ti' le wíimbala' entera ti' le IRF medido (función núukik instrumento), ka χ2 jach yan 1. Utia'al u calcular u kuxtal útil jump'éel chéen PN, le máscara mentik kex u wíinkilal nervioso bin dibujada manualmente yéetel le cuantificación kuxtal útil ti' Amal máscara bin utilizada.
Análisis u potencial mitocondrial. Ka' le sección aguda bin incubada yéetel 100 nM TMRM Jun añadido ti' le ACSF perfundido ichil 30 minutos, le cambios potenciales mitocondriales ti' PNs bino'ob medidos tumen juntúul microscopio ka'ap'éel fotones. Le imágenes TMRM u realizaron tumen excitación le sonda ti' 920 nm yéetel utilizando HyD interno (isotiocianato tetrametilrodamina: 585 leti' 40 nm) utia'al u recoger señales; yo'osal u búukinta'al le bak'paach longitud onda excitación Ba'ale' utilizando jump'éel HyD interno jela'an (FITC :525 leti' 50) utia'al u wíimbala' mtYFP. Meyaj le plug-in ImageJ's Image Calculator utia'al u evaluar le potencial mitocondrial ti' le nivel chen célula. Tu ke, le ecuación plug-in: señal = min (mtYFP, TMRM) ku meyajtiko'ob utia'al u identificar le región mitocondrial ku ye'esik le señal TMRM ti' Purkinje Somali ti' le wíimbala' confocal u chéen pila ti' le beel correspondiente. Tu láak' le yo'osal u píxeles ti' le máscara resultante ku cuantifica, ka tu láak' ku normaliza ti' le wíimbala' correspondiente umbral chéen pila ti' le beel mtYFP utia'al u kéen p'áatak le fracción mitocondrial ku ye'esik le potencial mitocondrial.
Le oochelo' bin deconvolutada yéetel software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Utia'al le oochelo'ob escaneadas ti' azulejos, le montaje jump'éel chéen azulejo ku beeta'al utilizando le algoritmo costura automática proporcionada tumen software LAS-X. Ka' u calibración le wíimbala', meyaj ImageJ yéetel Adobe Photoshop utia'al u procesar asab le wíimbala' yéetel ajustar uniformemente le lets'bal yéetel le contraste. Meyaj Adobe Illustrator uti'al u preparación gráfica.
Análisis u enfoque mtDNA. Le meyaj ku lesiones mtDNA bin u cuantificado ti' jaatso'ob cerebellar etiquetadas yéetel anticuerpos xu'ullsa'al ADN tumen microscopio confocal. Amal yo'osal objetivo bin u creada utia'al u wíinkilal ti' le célula yéetel u núcleo Amal célula, ka le yo'osal respectiva bin u calculada utilizando le plug-in Multi Measure (software ImageJ). Resta le yo'osal nuclear ti' le yo'osal u wíinkilal le célula utia'al u kéen p'áatak le yo'osal citoplasmática. Tu ts'ooke', le plug-in Analyze Particles (software ImageJ) bin utilizado utia'al u cuantificar automáticamente le ti'its ADN citoplasmático indicando mtDNA ti' le wíimbala' umbral, ka ya'ala'al máaxo'ob máano'ob obtenidos bino'ob normalizados ti' le promedio PN ti' ch'o'obo' CTRL. Ya'ala'al máaxo'ob máano'ob ku expresan bey le meyaj ku promedio u nucleósidos tumen célula.
Análisis u expresión le proteína. Meyaj le plug-in ImageJ's Image Calculator uti'al u p'is óoltik u expresión le proteína ti' PN ti' le nivel chen célula. Tu ke, ti' le wíimbala' confocal ti' jump'éel capa ti' le beel correspondiente, yo'osal le ecuación: señal = min (mtYFP, anticuerpo), ku identifica le región mitocondrial ku ye'esik inmunorreactividad ti' jump'éel jaaj anticuerpo ti' Purkina. Tu láak' le yo'osal u píxeles ti' le máscara resultante ku cuantifica, ka tu láak' ku normaliza ti' le wíimbala' umbral correspondiente ti' jump'éel chéen pila ti' le beel mtYFP utia'al u kéen p'áatak le fracción mitocondrial ti' le proteína ku ye'esik.
Análisis u densidad le células Purkinje. Le plug-in Cell Counter ti' ImageJ bin utilizado utia'al u evaluar le densidad Purkinje dividiendo le meyaj ku células Purkinje contadas tumen le longitud le ts'ipit k'ab cerebeloso ocupado tumen le células contadas.
Preparación yéetel recogida le muestras. Le ta ts'o'omej le múuch' kaambalil yo'osal yéetel le ch'o'obo' Mfn2cKO bino'ob fijados ti' 2% PFA leti' 2.5% glutaraldehído ti' 0.1 M tampón fosfato (PB), ka tu láak' jaatso'ob coronales bino'ob preparadas utilizando ciliados (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) (Espesor 50 u 60 μm) Le tampón fijación ti' 1% PB tetraóxido yéetel 1.5% ferrocianuro potasio ti' temperatura ambiente ichil 1 p'isib. Le jaatso'obo' bino'ob lavadas óoxtéen yéetel ja' destilada, ka tu láak' manchadas yéetel 70% etanol ku taasik 1% acetato uranilo ichil 20 minutos. Le jaatso'obo' bino'ob túun deshidratadas ti' alcohol graduado yéetel incrustadas ti' Durcupan ACM (araldite casting resin M) resina epoxi (Electron Microscopy Sciences, meyaj ku catálogo 14040) ichil diapositivas vidrio recubiertas u silicio, ka finalmente ti' 60 ° c polimerizar ti' le horno ichil 48 horas. U yo'osal u corteza cerebelosa bin seleccionada yéetel 50 nm jaatso'ob ultrafinas bino'ob cortadas ti' Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) yéetel recogidas ti' jump'éel cuadrícula ranura cobre 2 × 1 mm recubierta yéetel cha'ano' poliestireno. Le jaatso'obo' bino'ob manchadas yéetel juntúul solución 4 ti chúumuk acetato uranilo ti' H2O ichil 10 minutos, p'o'ik yéetel H2O ya'abkach Óoxten, ts'o'okole' yéetel citrato plomo Reynolds ti' H2O ichil 10 minutos, ka tu láak' p'o'ik yéetel H2O ya'abkach Óoxten. Micrografías bino'ob tomadas yéetel juntúul microscopio electrónico u transmisión Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) utilizando jump'éel TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 cámara digital (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Alemania).
Utia'al u ch'o'obo' infectados yéetel AAV, u ta ts'o'omej bin separado yéetel cortado ti' jump'éel sección sagital 1 mm espesor, ka le cerebelo bin examinado utilizando jump'éel microscopio fluorescencia utia'al u identificar le ts'ipit k'ab infectado yéetel AAV (es decir, expresando mCherry). Chéen experimentos tu'ux le inyección AAV resulta ti' jump'éel eficiencia transducción jach ka'anal ti' le capa celular Purkinje (es decir óol tuláakal le capa) ti' Ba'axten lo bey ka'ap'éel anillos cerebelosos consecutivos ku meyajtiko'ob. Le bucle transducido tumen AAV bin microdisecado utia'al u áak'ab post-fijación (4 ti chúumuk PFA yéetel 2.5 ti chúumuk glutaraldehído ti' 0.1 M tampón cacao) yéetel procesado asab táanil. Utia'al u incrustación EPON, le wa'ak'al fijo bin lavado yéetel 0.1 M tampón cacao sodio (Applichem), ka incubado yéetel 2 ti chúumuk OsO4 (os, Science Services; Caco) ti' 0.1 M tampón cacao sodio (Applichem) 4 horas, ts'o'okole' p'o'ik ichil 2 horas. beet 3 u téenel yéetel 0.1 M tampón cocamida. Ka' ts'o'oke', le serie ascendente ti' etanol bin utilizada utia'al u incubar Amal solución etanol ti' 4 ° c ichil 15 minutos utia'al u deshidratar le wa'ak'al. Le wa'ak'al bin u transferido ti' óxido propileno yéetel incubado ichil áak'ab ti' EPON (Sigma-Aldrich) ti' 4 ° c. Ts'áa le wa'ak'al ti' EPON túumben ti' temperatura ambiente ichil 2 horas, ka tu láak' ts'áa ti' 62°C ichil 72 horas. Meyaj juntúul ultramicrotoma (Leica Microsystems, UC6) yéetel juntúul cuchillo diamante (Diatome, Biel, Suiza) utia'al u ch'ak 70 nm jaatso'ob ultrafinas, ka manchar yéetel 1,5 ti chúumuk acetato uranilo ichil 15 minutos ti' 37 ° c, ka manchar yéetel solución citrato plomo 4 minutos. Le micrografías electrónicas bino'ob tomadas utilizando jump'éel microscopio electrónico u transmisión JEM-2100 Plus (JEOL) equipado yéetel Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) yéetel software DigitalMicrograph (Gatan). Utia'al u xak'alta'ale', u ch'a'abal micrografías electrónicas yéetel 5000× wa 10,000× zoom digital.
Análisis morfológico ti' le mitocondrias. Utia'al tuláakal le análisis, le contornos mitocondrias individuales bino'ob delineados manualmente ti' máak digitales utilizando software ImageJ. Ku xak'alta'al jejeláas parámetros morfológicos. U densidad le mitocondriao' ku ya'ala'al bey jump'éel porcentaje ku k'amik u ja'atsal u yo'osal mitocondrial total ti' Amal célula tumen u yo'osal le citoplasma (yo'osal u citoplasma = yo'osal u célula-yo'osal u núcleo le célula) × 100. Le redondez le mitocondrias ku calcula yéetel le fórmula [4π∙(yo'osal leti' perímetro 2)]. Le morfología ista ti' le mitocondrias bin analizada yéetel dividida ti' ka'ap'éel categorías ("tubular" yéetel "ampolla") bin u formas k'ajle'.
Análisis u meyaj ku autofagosoma leti' lisosoma yéetel densidad. Meyaj le software ImageJ uti'al u ts'íibtik manualmente u contornos Amal autofagosoma leti' lisosoma ti' le wíimbala' digital. Yo'osal u autofagosoma leti' lisosoma ku expresa bey juntúul porcentaje calculado dividiendo le yo'osal u ba'ax total u autofagosoma leti' lisosoma Amal célula tumen le yo'osal u citoplasma (yo'osal u citoplasma = yo'osal u célula-yo'osal u núcleo) × 100. U densidad le autofagosomas leti' lisosomas ku calcula dividiendo le meyaj ku total tumen le meyaj ku ba'ax autofagosoma leti' lisosoma tumen célula (ti' términos u yo'osal u citoplasma) (yo'osal u citoplasma = yo'osal u célula-yo'osal nuclear).
Etiquetado utia'al u sección aguda yéetel preparación le muestra. Utia'al u experimentos ku k'a'abetkuunsik u etiquetado glucosa, transferir le rodajas cerebrales agudas ti' jump'éel cámara preincubación, ku taasik carbono saturado (95% O2 yéetel 5% CO2), ka'anal Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón fosfato sodio, 2.5 mM NaCl, 205 mM d-glucosa, 1.0 mM CaCl 2 yéetel 2.0 mM MgCl 2, ajustado ti' pH 7.4 yéetel 310 u 320 mOsm), tu'ux le glucosa jach 13 C 6- Sustitución glucosa (Eurisotop, meyaj ku catálogo CLM-1396). Utia'al u experimentos ku k'a'abet u etiquetado piruvato, transferir le rodajas agudas ti' le ta ts'o'omej ti' asab Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón fosfato sodio, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucosa, 10 mM Ca.Cl yéetel Ad MgCl2, ajustar u pH 7.4 yéetel 310 u 320mOsm), ka añadir 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, meyaj ku catálogo CLM-1082). Incuba le jaatso'ob ichil 90 minutos ti' 37°C. Tu xuul le experimento, le jaatso'ob bino'ob jáan lavadas yéetel juntúul solución acuosa (pH 7.4) ku taasik 75 mM carbonato amonio, ka tu láak' homogeneizadas ti' 40:40:20 (v:v:v) acetonitrilo (ACN): metanol: ja'. Le ken ts'o'ok u incubar le jaatso'ob yóok'ol hielo ichil 30 minutos, le muestras bino'ob centrifugadas ti' 21.000 g ichil 10 minutos ti' 4 ° c, ka le sobrenadante jul bin u secado ti' jump'éel concentrador SpeedVac. Le pelotilla metabolito seco resultante bin almacenada ti' -80 ° c tak u análisis.
Análisis u espectrometría u masas u cromatografía líquida u 13 aminoácidos marcados yéetel C. Utia'al u análisis u cromatografía líquida-espectrometría u masas (LC-MS), le pelotilla metabolito bin u resuspendida ti' 75μl ja' grado LC-MS (Honeywell). Ka' u centrifugación ti' 21.000 g ichil 5 minutos ti' 4 ° c, 20 μl ti' le sobrenadante aclarado bin utilizado utia'al u análisis flujo aminoácidos, ka' jo'op' u u yala'ab le extracto bin utilizado inmediatamente utia'al u análisis aniones (wil in continuación). U xak'alil aminoácidos u beeta'al utilizando le protocolo derivatización u cloruro benzoilo descrito ka'achij (55, 56). Te' yáax paso, 10μl u 100 mM carbonato sodio (Sigma-Aldrich) ku ts'áabal ti' 20μl u extracto metabolitos, ka tu láak' 10μl u 2% cloruro benzoilo (Sigma-Aldrich) ku ts'áabal ti' le ACN grado LC. Le muestra bin vortexada brevemente ka tu láak' centrifugada ti' 21.000 g ichil 5 minutos ti' 20 ° c. Transferir le sobrenadante despejado ti' jump'éel vial automuestreador 2 ml yéetel juntúul inserto vidrio cónico (200 μl volumen). Le muestras bino'ob analizadas utilizando le yaan LC ultra-ka'anal rendimiento Acquity iClass (Waters) conectado ti' le Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) ka'anal resolución espectrómetro u juuch' precisión (Thermo Fisher Scientific). Utia'al u análisis, 2μl ti' le muestra derivada bin inyectada ti' jump'éel 100×1.0 mm ka'anal resistencia sílice T3 columna (Ja'ilo'ob) ku taasik 1.8μm partículas. Le velocidad flujo jach 100μl leti' min, yéetel le yaan tampón consiste ti' tampón A (10 mM formiato amonio yéetel 0.15 ti chúumuk ácido fórmico ichil ja') yéetel tampón B (ACN). Le gradiente jach bey Chúuns: 0%B ti' 0 minutos; 0%B. 0 tak 15% B ti' 0 tak 0.1 minutos; 15 tak 17% B ti' 0.1 tak 0.5 minutos; B ti' 17 u 55% ti' 0.5 u 14 minutos; B ti' 55 u 70% ti' 14 u 14.5 minutos; ti' 14.5 u 70 u 100% B ti' 18 minutos; 100% B ti' 18 u 19 minutos; 100 tak 0% B ti' 19 tak 19.1 minutos; 0% B ti' 19.1 u 28 minutos (55, 56). Le espectrómetro u juuch' QE-HF meyaj ti' modo ionización positiva yéetel juntúul rango juuch' m leti' z (relación juuch' leti' kuuch) u 50 u 750. Le resolución aplicada jach 60.000, yéetel le objetivo ion kaambalil yo'osal u ganancia (AGC) obtenido jach 3 × 106, yéetel le k'iin iones máximo jach 10 milsecondos. Le fuente ionización electrospray calentado (ESI) opera ti' jump'éel voltaje rocío u 3.5 kV, jump'éel temperatura capilar u 250 ° c, jump'éel flujo iik' vaina u 60 AU (unidades arbitrarias), yéetel juntúul flujo iik' auxiliar u 20 AU. 250°C. Le lente S ku je'ets'el ti' 60 AU.
Cromatografía aniónica-análisis MS ti' ácidos orgánicos etiquetados 13C. Le precipitado metabolito restante (55μl) bin analizado utilizando juntúul t.u.m cromatografía iones Dionex (ICS 5000 +, Thermo Fisher Scientific) conectado ti' jump'éel espectrómetro u juuch' QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Tu ke, 5μl u extracto metabolito bin inyectado ti' jump'éel columna Dionex IonPac AS11-HC equipada yéetel HPLC (2 mm×250 mm, Buka'aj partícula 4μm, Thermo Fisher Scientific) ti' modo bucle parcial push-in yéetel juntúul relación llenado 1. )on. Dionex IonPac AG11-HC guard column (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). U temperatura le columna ku mantiene ti' 30 ° c, yéetel le automuestreador ku establece ti' 6 ° c. Meyaj juntúul cartucho hidróxido potasio proporcionado yéetel ja' desionizada utia'al u generar jump'éel gradiente hidróxido potasio yo'osal le generador eluyente. U jatsbil le metabolitos ti' jump'éel flujo 380μl leti' min, aplicando le je'ela' gradiente: 0 u 3 minutos, 10 mM KOH; 3 tak 12 minutos, 10 tak 50 mM KOH; 12 tak 19 minutos, 50 tak 100 mM KOH; 19 u 21 minutos, 100 mM KOH; 21 tak 21.5 minutos, 100 tak 10 mM KOH. Le columna bin u ka'a equilibrada yáanal 10 mM KOH ichil 8.5 minutos.
Le metabolitos eluidos ku combinan yéetel juntúul flujo suplemento isopropanol 150μl leti' min ka' le columna ka tu láak' dirigido ti' jump'éel espectrómetro u juuch' ka'anal resolución operando ti' modo ionización negativa. MS táan u yilik le rango juuch' m leti' z 50 u 750 yéetel juntúul resolución 60.000. Le AGC ku je'ets'el ti' 1×106, yéetel le k'iin iones máximo ku mantiene ti' 100 ms. Le fuente ESI calentada bin operada ti' jump'éel voltaje aerosol u 3.5 kV. Le uláak' ajustes ti' le fuente iones ku le je'ela': temperatura capilar 275 ° c; flujo u gas u vaina, 60 AU; flujo gas auxiliar, 20 AU ti' 300°C, yéetel ajuste le lente S ti' 60 AU.
Análisis de datos de metabolitos etiquetados 13C. Meyaj le software TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific) uti'al u xak'alta'al datos ti' le relación isótopos. U identidad Amal compuesto bin verificada tumen juntúul compuesto k'a'ana'an confiable yéetel independientemente analizado. Utia'al u meentik análisis u enriquecimiento isótopos, le yo'osal u cromatograma iones extraídos (XIC) Amal isótopo 13C (Mn) bin extraído ti' [M + H] +, tu'ux n leti' le meyaj ku carbono ti' le compuesto objetivo, utilizado utia'al u analizar aminoácidos wa [ MH] + ku meyajtiko'ob utia'al u analizar aniones. Le exactitud juuch' XIC jach menos u jo'op'éel pak'chaje' tumen millón, yéetel le exactitud RT jach 0.05 minutos. Le análisis enriquecimiento ku beeta'al tumen cálculo le relación Amal isótopo detectado ti' le suma tuláakal le isótopos le compuesto correspondiente. Le k'iino'oba' proporciones ku ts'aik bey valores porcentuales utia'al Amal isótopo, ka ya'ala'al máaxo'ob máano'ob ku expresan bey enriquecimiento porcentual molar (MPE), bey descrito ka'achij (42).
Le pellet neurona congelada bin homogeneizada ti' hielo-frío 80 ti chúumuk metanol (v leti' v), vortexed, ka incubado ti' -20 ° c ichil 30 minutos. Vortex le muestra tu ka'atéen ka revuelva ti' + 4 ° C ichil 30 minutos. Le muestra bin centrifugada ti' 21.000 g ichil 5 minutos ti' 4 ° c, ka tu láak' le sobrenadante resultante bin recogida yéetel secada utilizando jump'éel concentrador SpeedVac ti' 25 ° c utia'al u análisis posterior. Bix u ya'ala'al ka'anal, u beeta'al análisis LC-MS ti' le aminoácidos ti' le células clasificadas. Utia'al u meyaj TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific), u xak'alil datos u beeta'al yéetel u juuch'il monoisótopo Amal compuesto. Le normalización cuantil ti' le datos metabolitos u realizó utilizando le paquete software preprocessCore (57).
U preparación le rebanada. Le ch'o'o' jáan bin anestesiado yéetel dióxido carbono ka decapitado, u ta ts'o'omej bin jáan retirado ti' le cráneo, ka le cuchillo vibrador Chuup yéetel hielo (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) bin utilizado utia'al u ch'ak ti' 300 u 375 μm jaatso'ob sagital gasificación carbono (25% CO) yéetel O Ca2 + ACSF yáanal (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón fosfato sodio, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucosa, 1.0 mM CaCl2 yéetel 6.0 mM MgCl2 Ajustar u pH 4 yéetel 30 mO 30). Transferir le rodajas u ta ts'o'omej obtenidas ti' jump'éel cámara ku taasik asab Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón fosfato sodio, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucosa, 4.0 ml mM Ca yéetel 5.5 mM) 7.4 yéetel 310 u 320 mOsm). Almacenar le rodajas ichil 20 u 30 minutos utia'al u páajtal u restaurados bey ma' grabar.
grabación. Utia'al tuláakal le grabacioneso' meyajnaj jump'éel p'isibij microscopio equipado yéetel juntúul cámara fija u grabación yéetel juntúul lente objetivo inmersión ja' 20 x (Scientifica). Le células Purkinje putativas bino'ob identificadas tumen (i) Buka'aj u ba'al u wíinkilal, (ii) tu'ux ku yaantal anatómica ti' le cerebelo, yéetel (iii) expresión le gen reportero mtYFP fluorescente. Le pipeta parche yéetel jump'éel resistencia xnuk 5 u 11 megohms ku jóok'sik tumen juntúul capilar vidrio borosilicato (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Alemania) yéetel juntúul pipeta horizontales Instruments (P-10000, Sutter, Notova, CA). Tuláakal le grabaciones bino'ob u realizadas tumen ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Alemania), ku bin controlado tumen le software Signal (versión 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Le experimento bin registrado ti' jump'éel velocidad muestreo 12.5 kHz. Le señal ku filtra yéetel ka'ap'éel filtros Bessel u paso corto yéetel frecuencias corte u 1.3 yéetel 10 kHz respectivamente. Le capacitancia ti' le membrana yéetel le pipeta ku compensa tumen le circuito compensación utilizando le amplificador. Tuláakal le experimentos bino'ob u realizados yáanal le kaambalil yo'osal jump'éel cámara Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemania), ku bin controlado tumen le software Hokawo (versión 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemania).
Configuración yéetel análisis rutinario ti' tuláakal le célula. Ma'ili' u k'a'abetkuunsa'ale', chu'up le pipeta yéetel le solución interna ku taasik le je'ela' sustancias: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM gluconato potasio, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (MM), 5 mM trifos (GTP) (Na) yéetel 10.0 mM fosfato creatinina ku ajustaron ti' pH 7.25, yéetel le presión osmótica bin 290 mOsm (sacarosa). Tu séeba'anil ka' u ts'a'abal jump'éel muuk' 0 pA uti'al u jats'ik le membranao', u p'iis u potencial le membrana descanso. Le resistencia ti' le entrada ku p'iss bey aplicando corrientes hiperpolarizadas u -40, -30, -20, yéetel -10 pA. P'iis u nojchil le núukik voltaje yéetel meyaj le ley Ohm utia'al u calcular le resistencia ti' le entrada. Le actividad espontánea bin u registrada ti' jump'éel abrazadera voltaje ichil 5 minutos, ka sPSC bin identificado yéetel medido ti' Igor Pro (versión 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) utilizando jump'éel script reconocimiento semiautomático. Le curva IV yéetel le sáasilo' estado estacionario ku p'iss bey tumen sujeción le batería ti' jejeláas potenciales (ku káajal le -110 mV) yéetel aumentando le voltaje ti' wook 5 mV. U beeta'al AP bin u probada tumen aplicar jump'éel sáasilo' despolarizante. Abraza le célula ti' -70 mV ka' jo'op' u aplica jump'éel pulso sáasilo' despolarizante. Ajuste le Buka'aj paso Amal unidad grabación tumen separado (10 u 60 pA). Calcular le frecuencia máxima AP tumen contando manualmente le picos pulso ku causan le asab frecuencia AP. Le umbral AP ku xak'alta'al yo'osal u búukinta'al le segunda derivada ti' le pulso despolarización ku yáax desencadena jump'éel wa asab APs.
Configuración yéetel análisis le parche perforado. Meentik grabación parche perforado utilizando protocolos estándar. Meyaj juntúul pipeta xma' ATP yéetel GTP ma' yaan ti' le je'ela' xak'o'ob: 128 mM gluconato K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA yéetel 2 mM MgCl2, ka ajustar u pH 7.2 (utilizando KOH). ATP yéetel GTP ku p'atiko'ob ti' le solución intracelular uti'al ma' u yantal permeabilidad ma' controlada ti' le membrana celular. Le pipeta parche Chuup yéetel juntúul solución interna ku taasik anfotericina (yan 200 u 250 μg leti' ml; G4888, Sigma-Aldrich) utia'al u kéen p'áatak jump'éel registro le parche perforado. Anfotericina bin u disuelta ti' dimetilo sulfóxido (concentración final: 0.1 u 0.3 ti chúumuk; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Le concentración DMSO utilizada mina'an ka'ach mix jump'éel efecto significativo ti' le neuronas estudiadas. ichil le tuukula' perforación, le resistencia le beel (Ra) bin continuamente monitoreada, ka le experimento bin u comenzado ka' u amplitud Ra yéetel AP estabilizó (20-40 minutos). Le actividad espontánea ku p'iss bey ti' jump'éel abrazadera voltaje yéetel leti' wa sáasilo' ichil 2 u 5 minutos. U xak'alil le datoso' beeta'ab yéetel Igor Pro (versión 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versión 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) yéetel GraphPad Prism (versión 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Estados Unidos). Utia'al u identificar le APs espontáneos, ku meyajtiko'ob le plug-in NeuroMatic v3.0c u IgorPro. Identificar automáticamente APs utilizando jump'éel umbral dado, ku ajusta individualmente utia'al Amal registro. Utilizando le intervalo pico, determinar le frecuencia pico yéetel le frecuencia pico instantánea máxima yéetel le frecuencia pico chúumuk.
PN aislamiento. Utia'al u adaptar u ti' le protocolo publicado ka'ache', PNs bin purificado ti' le cerebelo ch'o' ti' jump'éel p'isibij especificada (58). Tu ts'ooke', le cerebelo bin disecado yéetel picado ti' chúumuk disociación síis bey hielo [xma' HBSS Ca2 + yéetel Mg2 +, complementado yéetel 20 mM glucosa, penicilina (50 U leti' ml) yéetel estreptomicina (0.05 mg leti' ml)], ka tu láak' digerir le chúumuk ti' papain [HBSS, suplementado yéetel steína HBSS, 1 (1 mg leti' ml), papaína (16 U leti' ml) yéetel desoxirribonucleasa I (DNase I; 0.1 mg leti' ml)] Ts'aak ichil 30 minutos ti' 30°C. Yáax p'o'ik le wa'ak'al ti' chúumuk HBSS ku taasik moco je' (10 mg leti' ml), BSA (10 mg leti' ml) yéetel DNase (0.1 mg leti' ml) ti' temperatura ambiente utia'al Jech le digestión enzimática, ka tu láak' ti' le chúumuk HBSS ku taasik 20 mM glucosa Molienda suavemente ti' HBSS, peillina leti' ml 0,000 (0.0.5). (0.05 mg leti' ml) yéetel DNase (0.1 mg leti' ml) liberan células simples. Le suspensión celular resultante bin filtrada tumen juntúul colador celular 70μm, ts'o'okole' le células bino'ob pelletizadas tumen centrifugación (1110 rpm, 5 minutos, 4 ° C) yéetel resuspendidas ti' chúumuk clasificación [HBSS, complementado yéetel 20 mM glucosa, 20 ti chúumuk bovino fetal ) Suero, pelina (50) yéetel estrepcópica (0.05 mg/ml)]; evaluar le viabilidad celular yéetel yoduro propidio yéetel ajustar le densidad celular u 1 × 106 u 2 × 106 células leti' ml. Táanil ti' le citometría flujo, le suspensión bin filtrada tumen juntúul colador celular 50 μm.
Citómetro u flujo. U ts'a'abal le célulaso' beeta'ab tu 4°C yéetel u máquina FACSAria III (BD Biosciences) yéetel software FACSDiva (BD Biosciences, versión 8.0.1). Le suspensión celular bin u clasificada utilizando jump'éel boquilla 100 μm yáanal jump'éel presión 20 psi ti' jump'éel tasa ~ 2800 k'inbesajo'ob leti' seg. Tuméen le criterios gating xíiw (tamaño celular, discriminación bimodal, yéetel características dispersión) ma' táan u béeytal asegurar le aislamiento correcto ti' PN ti' uláak' tipos celulares, le estrategia gating ku establece basada ti' le comparación directa ti' le intensidad YFP yéetel le autofluorescencia ti' mitoYFP + yéetel le kanik mitoYFP - ch'o'obo'. YFP ku excita tumen irradiar le muestra yéetel juntúul internet ichil láser 488 nm, ka le señal ku detecta utilizando jump'éel filtro paso banda 530 leti' 30 nm. Ti' ch'o'obo' mitoYFP+, u muuk' relativa ti' le gen reportero Rosa26-mitoYFP xan ku meyajtiko'ob utia'al u distinguir u wíinkilal neuronal yéetel fragmentos axón. 7-AAD ku excita yéetel juntúul láser k'an 561 nm yéetel ku detecta yéetel juntúul filtro paso banda 675 leti' 20 nm utia'al u excluir le células kimen. Utia'al u separar le astrocitos in wéet k'iin, le suspensión celular bin manchada yéetel ACSA-2-APC, ts'o'okole' le muestra bin irradiada yéetel juntúul internet ichil láser 640 nm, ka jump'éel filtro paso banda 660 leti' 20 nm bin utilizado utia'al u detectar le señal.
Le células recogidas bino'ob pelletizadas tumen centrifugación (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) yéetel almacenadas ti' -80°C tak u búukinta'al. Ch'o'obo' Mfn2cKO yéetel u cachorros u camada ku clasifican ti' le k'iino' je'el xano' k'iin utia'al u minimizar le variabilidad procedimental. U ye'esajil yéetel u xak'alta'al le datos FACS beeta'ab yéetel software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Bix u ya'ala'al ka'anal (59), le PCR tu k'iinil xíimbal tumen ku meyajtiko'ob utia'al u aislar le ADN ti' le neuronas clasificadas utia'al u posterior cuantificación mtDNA. Le linealidad yéetel le sensibilidad umbral bino'ob probadas inicialmente tumen ejecutar qPCR ti' jejeláas meyaj ku u células. Tu kóom t'aan, much'ik 300 PN ti' jump'éel tampón lisis ku beetik 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 yéetel proteinasa K (200 ng leti' ml) yéetel incubar ti' 55°C 120 minutos. Le células bino'ob incubadas asab táanil ti' 95 ° c ichil 10 minutos utia'al u asegurar le inactivación completa ti' le proteinasa K. Usando jump'éel sonda TaqMan (Thermo Fisher) específica ti' mt-Nd1, mtDNA bin u medido tumen PCR semi-cuantitativo ti' le yaan 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fiscients Scientifics). Ciencia, meyaj ku catálogo Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, meyaj ku catálogo AIVI3E8) yéetel 18S (Thermo Fisher Scientific, meyaj ku catálogo Hs99999901_s1) genes.
U preparación le muestra proteoma. Ikil u k'íintik le solución ti' 95°C ichil 10 minutos yéetel sonicando, ti' le tampón lisis [6 M cloruro guanidina, 10 mM clorhidrato tris (2-carboxietil) fosfina, 10 mM cloroacetamida yéetel 100 mM tris- Lyse pellets neuronas congeladas ti' pellets HC]. Ti' Bioruptor (Diagenode) ichil 10 minutos (30 segundos pulso leti' 30 segundos período pausa). Le muestra bin diluida 1:10 ti' 20 mM tris-HCl (pH 8.0), mezclado yéetel 300 ng tripsina oro (Promega), ka incubado ichil áak'ab ti' 37 ° c utia'al u kaxta'al u yúuchul le digestión completa. Tu ka' k'iine', le muestra bin centrifugada ti' 20.000 g ichil 20 minutos. Le sobrenadante bin diluido yéetel 0.1% ácido fórmico, ka le solución bin desalada yéetel StageTips autohechos. Le muestra bin u tikintaj ti' jump'éel instrumento SpeedVac (concentrador Eppendorf asab 5305) ti' 45 ° c, ka tu láak' le péptido bin suspendido ti' 0.1 ti chúumuk ácido fórmico. Tuláakal le muestras bino'ob preparadas simultáneamente tumen le k'iino' je'el xano' máak. Utia'al u xak'alta'al le muestras astrocitos, 4 μg péptidos desalinados bino'ob etiquetados yéetel juntúul etiqueta juuch' tándem (TMT10plex, meyaj ku catálogo 90110, Thermo Fisher Scientific) yéetel juntúul relación péptido ti' reactivo TMT u 1:20. Utia'al u etiquetado TMT, 0.8 mg u reactivo TMT bin u resuspendido ti' 70 μl u ACN anhidro, ka le péptido seco bin u reconstituido ti' 9 μl u 0.1 M TEAB (bicarbonato trietilamonio), ti' le ku 7 μl u reactivo TMT ti' ACN u añadió. Le concentración bin 43.75%. Ka' 60 minutos u incubación, le reacción bin apagada yéetel 2 μl u 5 ti chúumuk hidroxilamina. Le péptidos etiquetados bino'ob recogidos, secados, resuspendidos ti' 200μl u 0.1% ácido fórmico (FA), divididos ti' ka'ap'éel, ka tu láak' desalinados utilizando StageTips autohechos. Utilizando UltiMate 3000 ultra ka'anal rendimiento cromatografía líquido (UltiMate 3000 ultra ka'anal rendimiento líquido cromatografía), juntúul le ka'ap'éel mitades bin fraccionada ti' jump'éel columna cromatográfica Acquity 1mm x 150mm Chuup yéetel partículas C18 130Å1.7μm (Waters, catálogo No SKU: 1966). Thermo Fisher Scientific). Separar le péptidos ti' jump'éel caudal 30μl leti' min, separar u 1 ti chúumuk u 50 ti chúumuk tampón B ichil 85 minutos yéetel juntúul gradiente paso a paso u 96 minutos, u 50 ti chúumuk u 95 ti chúumuk tampón B ichil 3 minutos, ts'o'okole' 8 minutos utia'al u 95 % tampón B; Le tampón A jach 5% ACN yéetel 10 mM bicarbonato amonio (ABC), yéetel le tampón B jach 80% ACN yéetel 10 mM ABC. Mool fracciones Amal 3 minutos ka combinar le ti' ka'ap'éel múuch' (1 + 17, 2 + 18, etc.) ka tikintaj le ti' jump'éel centrífuga ti' vacío.
Análisis LC-MS leti' MS. Utia'al u espectrometría u juuch', le péptidos (número r119.aq) bino'ob separados ti' jump'éel 25 cm, 75 μm metros interior PicoFrit columna analítica (túumben lente objetivo, meyaj ku nu'ukulil PF7508250) equipada yéetel 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ Q18-AQ medium (Maischr, Maisch, EY 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemania). Le columnao' tu p'ataj 50°C. Le tampón A yéetel B ku 0.1% ácido fórmico ichil ja' yéetel 0.1% ácido fórmico ichil 80% ACN, respectivamente. Le péptidos bino'ob separados yéetel juntúul gradiente paso a paso u 200 nl leti' min u 6 ti chúumuk u 31 ti chúumuk tampón B ichil 65 minutos, yéetel u 31 ti chúumuk u 50 ti chúumuk tampón B ichil 5 minutos. Le péptidos eluidos bino'ob analizados ti' jump'éel espectrómetro u juuch' Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Le p'iis m leti' z precursor péptido ku beeta'al yéetel juntúul resolución 120.000 ti' le rango 350 u 1500 m leti' z. Utilizando 27% energía colisión normalizada, le precursor asab k'a'am yéetel juntúul noj kuuch 2 u 6 u selecciona utia'al u hendidura disociación trampa C ka'anal energía (HCD). U k'iinil le ciclo ku je'ets'el ti' 1 s. Le je'o' m leti' z ti' le fragmento péptido bin u medido ti' le trampa iones utilizando le objetivo AGC asab chan u 5 × 104 yéetel le k'iin inyección máximo u 86 ms. Ka' u fragmentación, le precursor bin colocado ti' le tsoolol exclusión dinámica ichil 45 s. Le péptidos marcados yéetel TMT bino'ob separados ti' jump'éel columna Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, meyaj ku u catálogo 164942), yéetel le espectros migración bino'ob analizados ti' jump'éel espectrómetro u juuch' Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) equipado yéetel iones u ka'anal campo simétrico (IMS) nu'ukulil (Thermo Fisher Scientific) ku meyaj ti' ka'ap'éel voltajes compensación u −50 yéetel −70 V. MS3 seleccionado basado ti' le precursor sincronización ku meyajtiko'ob utia'al u medición señal iones informe TMT. Le separación péptido u tu bisaj ka'ansaj ti' EASY-nLC 1200, utilizando jump'éel elución gradiente lineal 90 ti chúumuk, yéetel juntúul concentración tampón 6 ti chúumuk u 31 ti chúumuk; tampón A bin 0.1% FA, yéetel tampón B bin 0.1% FA yéetel 80% ACN. Le columna analítica ku meyaj ti' 50°C. Meyaj FreeStyle (versión 1.6, Thermo Fisher Scientific) uti'al u ja'atsal le archivo áantajil bin u voltaje compensación FAIMS.
Identificación yéetel cuantificación le proteínas. Yéetel le motor xookilo' Andromeda integrado, le datos originales bino'ob analizados utilizando MaxQuant versión 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Beyxan ti' kaambalilo'ob le secuencias Cre recombinasa yéetel YFP obtenidas ti' Aequorea victoria, espectros fragmentos péptidos bino'ob buscados utia'al u secuencia canónica yéetel secuencia isoforma ti' le proteoma referencia ch'o' (Proteoma ID UP000000589, descargado ti' UniProt ti' mayo u 2017). Le oxidación metionina yéetel le acetilación N-terminal ti' le proteína ku ts'áabal bey modificaciones variables; le metilación carbamoil cisteína bin establecida bey modificaciones fijas. Le parámetros digestión ku establecen ti' "especificidad" yéetel "tripsina leti' P". Le meyaj ku mínimo u péptidos yéetel péptidos navaja utilizados utia'al u identificación proteínas jach 1; le meyaj ku mínimo u péptidos únicos jach 0. Yáanal le condiciones u coincidencia le mapa péptido, le tasa identificación proteína bin 0.01. Le opción "Segunda Péptido" táan activada. Meyaj le opción "match between runs" uti'al u transferir identificaciones exitosas ichil jejeláas archivos originales. Meyaj LFQ mínimo relación recuento 1 utia'al u cuantificación xma' etiqueta (LFQ) (60). Le intensidad LFQ ku filtra tumen Ba'axten lo bey ka'ap'éel valores válidos ti' Ba'axten lo bey jump'éel múuch' genotipo ti' Amal ch'aaj k'iin, ka u extrapola tak jump'éel distribución normal yéetel juntúul anchura u. 0.3 yéetel péek tak kaambal 1.8. Meyaj le plataforma informática Perseus (https://maxquant.net/perseus/) yéetel R (https://r-project.org/) uti'al u xak'altik u resultadoil le LFQ. Utia'al u análisis le expresión diferencial (61) meyajnaj jump'éel prueba t moderado ka'ap'éel vías ti' le paquete software limma. U xak'alil datos exploratorios ku beeta'al yéetel ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally yéetel pheatmap. Le datos proteómicos basados ​​ti' TMT bino'ob analizados utilizando MaxQuant versión 1.6.10.43. Kaxant datos proteómicos crudos ti' le k'oja'ano'obo' u datos proteómicas humanas u UniProt, ku bin descargado ti' septiembre u 2018. Le análisis analte'obo' yaan le factor corrección pureza isótopo proporcionado tumen le fabricante. Meyaj limma ti' R uti'al u análisis expresión diferencial. Le datos originales, ya'ala'al máaxo'ob máano'ob xookilo' k'oja'ano'obo' u datos, yéetel flujo meyaj análisis datos yéetel ya'ala'al máaxo'ob máano'ob tuláakal ku almacenan ti' le alianza ProteomeXchange yo'osal le repositorio socio PRIDE yéetel le identificador conjunto datos PXD019690.
Le anotaciones funcionales ku ayik'alkúunsik le análisis. Le nu'ukula' Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) bin utilizado utia'al u determinar le ayik'alil le términos anotación funcional ti' le conjunto datos ti' 8 semanas (yoochel 1). Tu ke, le tsoolol proteínas cuantitativas obtenidas ti' LC-MS leti' MS (espectrometría u masas tándem) análisis datos ku meyajtiko'ob yéetel le je'ela' criterios filtro: Mus musculus ku selecciona bey le especie yéetel ju'unil tu'ux yaan, ka le categoría ye'esik le je'o' P ajustado tumen Benjamini utia'al u enriquecimiento 0.05 wa menor ku considera significativo. Utia'al le gráfico, ku ye'esik le jo'op'éel categorías exceso ti' Amal clúster basado ti' le je'o' P ajustado. Utilizando ya'ab k'oja'ano'ob t-test, utilizando le cha'ana' impulso lineal u ka'ap'éel p'isibij u Benjamini, Krieger, yéetel Yekutieli (Q = 5%), análisis expresión proteína k'iin-curso ku beeta'al ti' le candidatos importantes identificados ti' Amal categoría, ka Amal fila ku analiza tumen separado. Ma' k'a'abéet u ch'a'abal jump'éel SD consistente.
Utia'al u comparar ya'ala'al máaxo'ob máano'ob le xooko' yéetel k'oja'ano'obo' u datos publicadas yéetel generar jump'éel diagrama Venn ti' le yoochel 1, combinamos le tsoolol proteínas cuantitativas yéetel anotaciones MitoCarta 2.0 (24). Meyaj le nu'ukula' ti' internet ichil Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) uti'al u beetik le diagrama.
Utia'al u a'alajil t'aan detallada yóok'ol le procedimientos estadísticos utilizados utia'al u análisis proteómico, Béet consulte le sección correspondiente ti' materiales yéetel métodos. Utia'al tuláakal le uláak' experimentos, a'alajil t'aan detallada je'el u páajtal u kaxtik ti' le leyenda correspondiente. Wa ma' u ya'ala'al uláak' bix ken, tuláakal le datos ku expresan bey promedio ± SEM, ka tuláakal le análisis estadísticos u realizaron utilizando software GraphPad Prism 8.1.2.
Utia'al u láak' ba'alo'ob uti'al le artículoa', wil http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Lela' jump'éel artículo u muuk' abierto distribuido yáanal le términos le licencia Creative Commons Attribution-Non-Commercial, ku cha'antik u búukinta'al, distribución yéetel reproducción ti' je'el ba'ax medios, siempre yéetel ken u búukinta'al final ma' u utia'al u ganancia comercial yéetel le premisa jach u le meyajo' áantajil jach correcto. Reeferensia.
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Tuméen E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Le análisis proteómico ti' le neuronas disfuncionales tu ye'esaj u le programas metabólicos ku activan utia'al u contrarrestar le neurodegeneración.
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©2020 Asociación Americana utia'al u táanil le ciencia. tuláakal u páajtalilo'ob. AAAS leti' jump'éel socio ti' HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef yéetel COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.