Nib óolal ikil a xíimbaltik Nature.com. Le versión le navegador ku meyajtiko' yaan jump'éel áantaj CSS limitado. Utia'al u ma'alo'ob ya'ala'al máaxo'ob máano'ob, ti' recomendamos u utilizar jump'éel versión asab túumben ti' u navegador (wa desactivar modo compatibilidad ti' Internet Explorer). ichil le k'iino'oba', uti'al u yantal áantaj, k we'esik le ts'ono'oto' xma' estilo wa JavaScript.
Le ácido propiónico (PPA) ku meyaj uti'al u xak'alta'al u meyaj le disfunción mitocondrial ti' le trastornos neurodesarrollo bey le trastorno ti' le espectro autista. PPA leti'e' k'ajóolta'an tumen interrumpir le biogénesis mitocondrial, metabolismo yéetel rotación. Ba'ale', le táanil le PPA ti' le dinámica mitocondrial, le fisión yéetel le fusión siguen siendo problemáticos debido a le compleja naturaleza temporal ti' le k'iino'oba' mecanismos. Te'ela', utilizamos kaambalilo'ob u imagen cuantitativas complementarias utia'al u investigar bix PPA afecta le ultraestructura mitocondrial, morfología, yéetel dinámica ti' células SH-SY5Y bey neuronas. PPA (5 mM) tu beetaj jump'éel disminución significativa ti' le yo'osal mitocondrial (p < 0.01), metros yéetel circunferencia Feret (p < 0.05), yéetel yo'osal 2 (p < 0.01). Le análisis localizador k'inbesajo'ob mitocondriales tu ye'esaj jump'éel aumento significativo (p < 0.05) ti' le k'inbesajo'ob fisión yéetel fusión, manteniendo bey le integridad le páawo'ob mitocondrial yáanal condiciones estrés. Beyxan, le expresión mRNA ti' cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) yéetel OPA1 (p < 0.05) bin significativamente reducida. 01). Le je'ela' ku ye'esik u remodelación le morfología mitocondrial, biogénesis yéetel dinámica utia'al u mantener le función yáanal condiciones estrés. K datos proporcionan túumben visión ti' le táanil le PPA ti' le dinámica mitocondrial yéetel destacan le utilidad le kaambalilo'ob u imagen utia'al u xook le mecanismos regulatorios complejos involucrados ti' le respuestas estrés mitocondrial.
Le mitocondrias ku táakpajalo'ob ti' jump'éel variedad noj celulares asab te'elo' u u ju'uno'ob típicos ti' le producción energía yéetel biosíntesis. Le metabolismo mitocondrial jach jump'éel regulador clave ti' le señalización calcio, homeostasis metabólica yéetel redox, señalización inflamatoria, modificaciones epigenéticas, proliferación celular, diferenciación yéetel kíimile' celular programada1. Tu particular, le metabolismo mitocondrial jach crítico utia'al u ma'alo'ob neuronal, supervivencia yéetel función yéetel táan ampliamente implicado ti' jejeláas manifestaciones le neuropatología2,3,4.
ichil le ts'ook k'iino'oba', le noj metabólico ts'o'ok u chíikpajal bey jump'éel regulador central ti' le neurogénesis, diferenciación, maduración yéetel plasticidad5,6. Ma' úuch, u morfología yéetel u dinámica le mitocondrias ku suutikuba'ob componentes particularmente importantes ti' le mitosis, jump'éel tuukula' dinámico ku mantiene jump'éel piscina mitocondrias saludables ichil le células. Le dinámica mitocondrial ku regula tumen vías interdependientes complejas ku bino'ob tak le biogénesis mitocondrial yéetel le bioenergética tak le fisión mitocondrial, fusión, transporte yéetel limpieza7,8. U k'askúunta'al je'el máaxak ti' le mecanismos integrativos ku k'askúuntik u mantenimiento le redes mitocondriales saludables yéetel yaan consecuencias funcionales profundas utia'al u neurodesarrollo9,10. Jach jaajile', le disregulación ti' le dinámica mitocondrial ku yila'al ti' ya'ab trastornos psiquiátricos, neurodegenerativos yéetel neurodesarrollo, incluyendo trastornos ti' le espectro autista (TEA)11,12.
ASD jump'éel k'oja'anil neurodesarrollo heterogéneo yéetel jump'éel arquitectura genética yéetel epigenética compleja. Le herencia ti' le ASD jach indiscutible, ba'ale' le etiología molecular subyacente sigue siendo k'aas entendida. U much'ik datos ti' modelos preclínicos, xook clínicos yéetel conjuntos datos moleculares multi-ómicas ku ts'aik jump'éel creciente evidencia ti' le disfunción mitocondrial ti' ASD13,14. Ka'ache' k meentik jump'éel pantalla metilación ADN ti' tuláakal le genoma ti' jump'éel cohorte k'oja'ano'ob yéetel ASD yéetel identificamos genes metilados diferencialmente agrupados a lo largo de vías metabólicas mitocondriales15. Ka' ts'o'oke', k ts'áaj ojéeltbil metilación diferencial ti' le reguladores centrales ti' le biogénesis yéetel le dinámica mitocondrial, ku bin asociada yéetel aumento meyaj ku copias mtDNA yéetel alterado perfil metabólico urinario ti' ASD16. K datos proporcionan creciente pruebas u dinámica mitocondrial yéetel homeostasis desempeñan jump'éel ju'un k'ajle' ti' le fisiopatología le ASD. Le o'olale', ma'alo'obkíinsiko'ob u comprensión mecánica ti' le relación ichil le dinámica mitocondrial, morfología yéetel función jach jump'éel meta clave ti' le investigación continua ti' k'aas k'oja'anilo'obo' neurológicas caracterizadas tumen disfunción mitocondrial p'iskaambal.
Le kaambalilo'ob moleculares ku meyajtiko'ob tu menudo utia'al u xook le ju'uno' le genes específicos ti' le respuestas estrés mitocondrial. Ba'ale', le enfoque je'el u páajtal u limitado tumen le naturaleza multifacética yéetel temporal ti' le mecanismos kaambalil yo'osal mitótico. Beyxan, le expresión diferencial ti' le genes mitocondriales jach jump'éel indicador indirecto ti' le cambios funcionales, especialmente ts'o'ok u chéen jump'éel meyaj ku limitado u genes ku analizan típicamente. Le o'olale', u séen propuesto métodos asab directos utia'al u xook le función mitocondrial yéetel le bioenergética17. U morfología le mitocondria jach yaan ba'al u yil yéetel u dinámica le mitocondriao'. U beyo' le mitocondria, u conectividad yéetel u ba'ax le críticos utia'al u producción energía yéetel supervivencia mitocondrial yéetel celular5,18. Beyxan, le jejeláas ba'alo'ob ku beetik le mitosis ku ts'áaik u yóolo'ob ti' le cambios ti' le morfología mitocondrial, ku páajtal u meyaj bey extremos útiles ti' le disfunción mitocondrial yéetel ts'aik jump'éel k'oja'ano'obo' utia'al u xook mecanísticos posteriores.
Le morfología mitocondrial je'el u páajtal u observada Jun utilizando microscopía electrónica u transmisión (TEM), ku cha'antik xook detallado ti' le ultraestructura celular. TEM Jun visualiza le morfología, beyo' yéetel ba'ax le cristae mitocondrial ti' le resolución le mitocondrias individuales, kúuchil depender chéen ti' le transcripción genética, expresión proteína wa parámetros funcionales mitocondriales ti' le poblaciones celulares17,19,20. Beyxan, TEM ku yáantik u xookil le interacciones ichil le mitocondrias yéetel uláak' orgánulos, bey le retículo endoplásmico yéetel le autofagosomas, ku báaxal ju'uno'ob clave ti' le función mitocondrial yéetel le homeostasis21,22. Beyo', le je'ela' ku beetik u TEM jump'éel ma'alo'ob ch'aaj partida utia'al u xook le disfunción mitocondrial bey ma' centrar u ti' vías específicas wa genes. Bix u meyaj le mitocondria ku p'áatal ti' asab k'a'anan ti' le neuropatología, yaan jump'éel necesidad chika'an u páajtal u xook Jun yéetel cuantitativamente le morfología yéetel le dinámica mitocondrial ti' modelos neuronales in vitro.
Te'e artículoa', k xak'altik u dinámica le mitocondria ti' jump'éel bix neuronal ti' le disfunción mitocondrial ti' le trastorno espectro autista. Ka'ache' k ts'áaj ojéeltbil u metilación diferencial ti' le propionil-CoA carboxilasa beta (PCCB) ti' ASD15, jump'éel subunidad ti' le enzima carboxilasa propionil-CoA mitocondrial PCC. Le disregulación PCC leti'e' k'ajóolta'an tumen causar acumulación tóxica u derivados propionilo, incluyendo ácido propiónico (PPA)23,24,25. PPA ts'o'ok u demostrado u interrumpir le metabolismo neuronal yéetel alterar le comportamiento in vivo yéetel jach jump'éel bix ba'alche'o' establecido utia'al u xook mecanismos neurodesarrollo involucrados ti' ASD26,27,28. Beyxan, PPA ts'o'ok u ya'ala'ale' ku k'askúuntik u páajtalil le membrana mitocondrial, le biogénesis yéetel le respiración in vitro yéetel ts'o'ok u utilizado ampliamente utia'al u modelar le disfunción mitocondrial ti' le neuronas29,30. Ba'ale', u impacto le disfunción mitocondrial inducida tumen PPA ti' le morfología yéetel le dinámica mitocondrial sigue siendo k'aas entendido.
Le xooko' meyajtiko'ob kaambalilo'ob u imagen complementarias utia'al u cuantificar le táanil le PPA ti' le morfología mitocondrial, dinámica yéetel función ti' le células SH-SY5Y. Yáax, desarrollamos jump'éel método TEM utia'al u visualizar cambios ti' le morfología mitocondrial yéetel le ultraestructura17,31,32. Tuméen le dinámica ku mitocondria33, xan utilizamos análisis localizador k'inbesajo'ob mitocondriales (MEL) utia'al u cuantificar cambios ti' le equilibrio ichil k'inbesajo'ob fisión yéetel fusión, meyaj ku mitocondrial yéetel volumen yáanal estrés PPA. Tu ts'ooke', k xak'altik wa le morfología yéetel le dinámica mitocondrial ku asocian yéetel cambios ti' le expresión genes involucrados ti' le biogénesis, fisión yéetel fusión. Tu láakal, k datos ilustran le desafío u elucidar le complejidad le mecanismos ku regulan le dinámica mitocondrial. K destacamos u utilidad le TEM ti' le xook morfología mitocondrial bey juntúul ch'aaj final convergente medible ti' le mitosis ti' células SH-SY5Y. Beyxan, k destacamos u datos TEM proporcionan le a'alajil t'aan asab ayik'al ken u combina yéetel kaambalilo'ob u imagen ku xan capturan k'inbesajo'ob dinámicos ti' núukik le estrés metabólico. Uláak' caracterización ti' le mecanismos regulatorios moleculares ku yáanta'al le mitosis células neuronales je'el u páajtal u ts'aik jump'éel visión Páaybe'en ti' le componente mitocondrial ti' le yaan nervioso yéetel le k'aas k'oja'anilo'obo' neurodegenerativas.
Utia'al u inducir le estrés mitocondrial, le células SH-SY5Y bino'ob tratadas yéetel PPA utilizando 3 mM yéetel 5 mM propionato sodio (NaP). Bey ma' TEM, le muestras bino'ob sometidas ti' le preparación muestra criogénica utilizando congelación yéetel congelación u ka'anal presión (Fig. 1a). K desarrollamos jump'éel tubería análisis wíimbala' mitocondrial automatizada utia'al u P'iis Ukp'éel parámetros morfológicos ti' le poblaciones mitocondriales ichil óoxp'éel réplicas biológicas. K encontramos u Ts'a'akal PPA significativamente k'ex kan parámetros: yo'osal 2, yo'osal, perímetro, yéetel metros Feret (Fig. 1b-e). Le kúuchil 2 jach t'okik yéetel 3 mM yéetel 5 mM PPA Ts'a'akal (p = 0.0183 yéetel p = 0.002, respectivamente) (Fig. 1b), ka' jo'op' u kúuchil (p = 0.003), perímetro (p = 0.0106) yéetel metros Feret tuláakal u disminuido significativamente. Yaan ka'ach jump'éel reducción significativa (p = 0.0172) ti' le múuch' Ts'a'akal 5 mM ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal (Fig. 1c-e). Le reducciones significativas ti' le yo'osal yéetel le circunferencia mostraron u le células tratadas yéetel 5 mM PPA yaan ka'ach mitocondrias asab mejen, asab redondeadas, ka u le k'iino'oba' mitocondrias bino'ob menos alargadas u le ti' le células kanik. Le je'ela' xan u bin yéetel jump'éel disminución significativa ti' le metros Feret, jump'éel parámetro independiente ku indica jump'éel disminución ti' le asab distancia ichil le bordes partículas. Ku yila'al cambios ti' le ultraestructura le cristae: le cristae ku suutikuba'ob menos pronunciadas yáanal le influencia le estrés PPA (Fig. 1a, panel B). Ba'ale', ma' tuláakal le oochelo'obo' ku ye'esik chika'an u ultraestructura le cristae, bey u ma' u meentik jump'éel análisis cuantitativo ti' le k'iino'oba' cambios. Le datos TEM je'el u páajtal u reflejar óoxp'éel posibles escenarios: (1) PPA mejora le fisión wa inhibe le fusión, causando u mitocondrias existentes u encoger ti' Buka'aj; (2) le biogénesis mejorada crea túumben, asab mejen mitocondrias wa (3) induce ambas mecanismos simultáneamente. Kex le k'iino'oba' condiciones ma' táan u béeytal u distinguidas tumen TEM, cambios morfológicos significativos indican cambios ti' le homeostasis mitocondrial yéetel le dinámica yáanal estrés PPA. Ka' ts'o'oke' k exploramos parámetros adicionales utia'al u caracterizar asab le k'iino'oba' dinámicos yéetel le mecanismos potenciales subyacentes ti' leti'ob.
Le ácido propiónico (PPA) ku k'exik u morfología le mitocondria. (a) máak u microscopía electrónica u transmisión representativa (TEM) ku ye'esik u Buka'aj mitocondrial disminuye yéetel le mitocondrias ku suutikuba'ob asab mejen yéetel asab redondeadas yéetel aumento le Ts'a'akal PPA; 0 mM (ma' tratado), 3 mM yéetel 5 mM, respectivamente. le flechas rojas ku ye'esik le mitocondrias. (b-e) SH-SY5Y células tratadas yéetel PPA ichil 24 h bino'ob preparadas utia'al u TEM yéetel ya'ala'al máaxo'ob máano'ob bino'ob analizados utilizando Fiji leti' ImageJ. Kanp'éel ti' le waxak parámetros mostraron diferencias significativas ichil le células kanik (ma' tratadas, 0 mM PPA) yéetel tratadas (3 mM yéetel 5 mM PPA). (b) Región 2, (c) Área, (d) Perímetro, (e) Feret metros. Utia'al u yojéelta'al u jela'anil jach k'a'anan (p < 0.05) meyajnaj análisis unidireccional ti' le varianza (kaambalil yo'osal leti' Ts'a'akal) yéetel le prueba comparación múltiple u Dunnett (p < 0.05). Le ti'its datos representan le je'o' mitocondrial chúumuk utia'al Amal célula individual, yéetel barras ba'alo' representan le promedio ± SEM. Le datos ku ye'esa'alo'obo' ku chíikbesiko'ob n = 3, Ba'axten lo bey 24 células tumen replicado; jump'éel total u 266 máak bino'ob analizadas; * ku ye'esik p < 0.05, ** ku ye'esik p < 0.01.
Utia'al u caracterizar asab bix u núukik le dinámica mitocondrial ti' le PPA, k manchado le mitocondrias yéetel éster etilo tetrametilrodamina (TMRE) yéetel utilizamos microscopía lapso k'iin yéetel análisis MEL utia'al u localizar yéetel cuantificar le mitocondrias ka' 24 horas ti' 3 yéetel 5 mM PPA. Ts'a'akal u k'inbesajo'ob u fisión yéetel fusión. (Fig. 2a). Ka' ts'o'ok u xak'alta'al MEL, le mitocondrias bino'ob asab analizadas utia'al u cuantificar le meyaj ku ba'ax mitocondriales yéetel u volumen chúumuk. K ilik jump'éel chan ba'ale' jach k'a'anan u ya'abtal le meyaj ku k'inbesajo'ob u fisión ku yúuchul ti' 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] ti' comparación yéetel le fisión [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] yéetel le fusión [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] yéetel le fusión [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] yéetel le fusión [5.4 ± 0.5) (p < 0.05) [0.05]. 0.05)] <0.05)] k'inbesajo'ob bino'ob significativamente aumentados ti' 5 mM ti' comparación yéetel le kaambalil yo'osal (Fig. 3b). Le meyaj ku mitocondrias aumentó significativamente ti' le ka'ap'éel 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] yéetel 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Fig. 3c) , ka' jo'op' u le volumen promedio Amal ba'ax mitocondrial permaneció xma' cambios (Fig. 3c). 3d). Tu láakal, le je'ela' sugiere u remodelación le dinámica mitocondrial meyaj bey jump'éel núukik compensatoria ku mantiene belal le integridad le páawo'ob mitocondrial. Le aumento ti' le meyaj ku k'inbesajo'ob u fisión ti' 3 mM PPA sugiere u le aumento ti' le meyaj ku mitocondrial jach tu parte debido a le fisión mitocondrial, ba'ale' ts'áaik u le volumen mitocondrial chúumuk permanece esencialmente ma' k'expajal, le biogénesis ma' u páajtal descartar bey jump'éel núukik compensatoria adicional. Ba'ale', le k'iino'oba' datos ku consistentes yéetel le ba'ax mitocondriales asab mejen, wóoliso'ob observadas tumen TEM yéetel xan demostran cambios significativos ti' le dinámica mitocondrial inducida tumen PPA.
Le ácido propiónico (PPA) ku beetik u yantal jump'éel remodelación mitocondrial dinámica uti'al u mantener u integridad le páawo'ob. Le células SH-SY5Y bino'ob cultivadas, tratadas yéetel 3 yéetel 5 mM PPA ichil 24 horas yéetel manchadas yéetel TMRE yéetel Hoechst 33342 seguido tumen análisis MEL. (a) máak representativas ti' microscopía u lapso k'iin ku ye'esik u boonil yéetel proyecciones u intensidad máxima binarias ti' le k'iin 2 (t2) utia'al Amal condición. Le regiones seleccionadas ku ye'esik ti' Amal wíimbala' binaria ku mejoran yéetel ku ye'esik ti' 3D ti' óoxp'éel marcos k'iin jejeláas (t1-t3) utia'al u ilustrar le dinámica ichil le k'iin; le k'inbesajo'ob fusión ku chíikpajal yéetel ya'ax; le k'inbesajo'ob fisión ku chíikpajal yéetel ya'ax. ku ye'esa'al yéetel chak. (b) meyaj ku chúumuk u k'inbesajo'ob dinámicos tumen condición. (c) meyaj ku chúumuk u ba'ax mitocondriales tumen célula. (d) Volumen chúumuk (μm3) ti' Amal ba'ax mitocondrial tumen célula. Le datos ku ye'esa'alo'obo' ku chíikbesiko'ob n = 15 células tumen múuch' Ts'a'akal. Le barras ba'alo' ku ye'esa'alo'obo' ku chíikbesiko'ob u chúumuk ± SEM, barra u escala = 10 μm, * p < 0.05.
Le ácido propiónico (PPA) ku beetik u supresión le transcripción ti' le genes asociados yéetel le dinámica mitocondrial. Le células SH-SY5Y bino'ob tratadas yéetel 3 yéetel 5 mM PPA ichil 24 h. Le cuantificación relativa ti' le genes u tu beetaj utilizando RT-qPCR yéetel normalizada u B2M. Genes u biogénesis mitocondrial (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 yéetel (d) NFE2L2. Le genes u fusión yéetel fisión mitocondriales (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 yéetel (i) DRP1. Diferencias significativas (p < 0.05) bino'ob probadas utilizando ANOVA unidireccional (kaambalil yo'osal vs. Ts'a'akal) yéetel prueba comparación múltiple u Dunnett: * indica p < 0.05, ** indica p < 0.01, yéetel **** indica p < 0.0001. Le barras ku chíikbesiko'ob le expresión media ± SEM. Le datos ku ye'esa'alo'obo' ku chíikbesiko'ob n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), yéetel n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) réplicas biológicas.
Le datos ti' le análisis TEM yéetel MEL múuch' indican u PPA altera le morfología yéetel le dinámica mitocondrial. Ba'ale', le k'iino'oba' kaambalilo'ob u imagen ma' proporcionan visión ti' le mecanismos subyacentes ku conducen le k'iino'oba' procesos. Le o'olale', examinamos le expresión mRNA u nueve reguladores clave ti' le dinámica mitocondrial, biogénesis yéetel mitosis ti' núukik le Ts'a'akal PPA. K cuantificamos oncogeno mieloma celular (cMYC), factor respiratorio nuclear (NRF1), factor transcripción mitocondrial 1 (TFAM), NFE2-like transcription factor BZIP (NFE2L2), gastrin-like protein 2 (STOML2), atrofia nervio óptico 1 (OPA1 ), Mitofusina 1 (MFN1), Mitofusin (MFN2) yéetel MitoFN2 (2). proteína 1 relacionada yéetel dinamina (DRP1) ka' 24 horas u Ts'a'akal yéetel 3 mM yéetel 5 mM PPA. K ilik 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 yéetel p < 0.0001, respectivamente) yéetel 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) Ts'a'akal PPA. (Fig. 3a-c). Le disminución ti' le expresión mRNA bin dependiente ti' le dosis: le expresión cMYC, NRF1 yéetel TFAM disminuyó tumen 5.7, 2.6 yéetel 1.9 Óoxten ti' 3 mM, respectivamente, yéetel tumen 11.2, 3 yéetel 2.2 Óoxten ti' 5 mM. U jela'anil, le gen biogénesis redox central NFE2L2 ma' bin alterado ti' je'el concentración PPA, kex jump'éel tendencia similar dependiente ti' le dosis u disminución le expresión bin u observada (Fig. 3d).
Xan examinamos le expresión genes clásicos involucrados ti' le regulación le fisión yéetel le fusión. STOML2 ku tukulta'al u táakpajal ti' le fusión, mitofagia yéetel biogénesis, ka u expresión bin significativamente reducida (p < 0.0001) tumen 3 mM (2.4-fold k'eexpajal) yéetel 5 mM (2.8-fold k'eexpajal) PPA (Fig. 1). 3d). Bey xan, le expresión genética fusión OPA1 disminuyó ti' 3 mM (1,6 Óoxten k'eexpajal) yéetel 5 mM (1,9 Óoxten k'eexpajal) PPA (p = 0,006 yéetel p = 0,0024, respectivamente) (Fig. 3f). Ba'ale', ma' k encontramos diferencias significativas ti' le expresión genes fusión MFN1, MFN2 wa gen fisión DRP1 yáanal estrés PPA 24-h (Fig. 3g-i). Beyxan, k encontramos u le niveles kantúul proteínas fusión yéetel fisión (OPA1, MFN1, MFN2 yéetel DRP1) ma' k'expajal yáanal le bak'paach condiciones (Fig. 4a-d). Jach k'a'anan u ya'ala'ale' le k'iino'oba' datos ku ye'esik jump'éel chéen ch'aaj ti' le k'iino' yéetel je'el ma' reflejar cambios ti' le expresión proteína wa le niveles actividad ichil le yáax p'isibij estrés PPA. Ba'ale', le reducciones significativas ti' le expresión cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, yéetel OPA1 indican disregulación transcripcional significativa ti' le metabolismo mitocondrial, biogénesis yéetel dinámica. Beyxan, le k'iino'oba' datos ku ye'esik u utilidad le kaambalilo'ob u imagen utia'al u xook Jun cambios ti' le noj final ti' le función mitocondrial.
Le niveles proteínas factor fusión yéetel fisión ma' k'expajal ka' u Ts'a'akal ácido propiónico (PPA). Le células SH-SY5Y bino'ob tratadas yéetel 3 yéetel 5 mM PPA ichil 24 h. Le niveles proteínas bino'ob cuantificados tumen análisis Western blot, ka le niveles expresión bino'ob normalizados ti' le proteína total. Ku ye'esa'al u chúumuk u ye'esajil le proteína yéetel le Western blots representativos ti' le proteína objetivo yéetel total. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Le barras ku chíikbesiko'ob u chúumuk ± SEM, yéetel le datos ku ye'esa'alo'obo' ku chíikbesiko'ob n = 3 réplicas biológicas. Ya'abkach comparaciones (p < 0.05) u realizaron utilizando análisis unidireccional ti' le varianza yéetel prueba Dunnett. Le gel áantajil yéetel le blot ku ye'esik ti' le yoochel S1.
Le disfunción mitocondrial ku asocia yéetel k'aas k'oja'anilo'obo' multisistema ku bino'ob tak k'aas k'oja'anilo'obo' metabólicas, cardiovasculares yéetel musculares tak k'aas k'oja'anilo'obo' neurológicas1,10. Ya'ab k'oja'anilo'ob neurodegenerativas yéetel neurodegenerativas ku bisikuba'ob yéetel le disfunción mitocondrial, ku ye'esik u k'a'ana'anil le k'iino'oba' orgánulos ichil tuláakal u kuxtal le ta ts'o'omej. Le k'oja'anilo'oba' leti'obe' k'oja'anil Parkinson, k'oja'anil Alzheimer yéetel ASD3,4,18. Ba'ale', u yokol u wa'ak'al u ts'o'omel pool uti'al u xak'alta'al le k'oja'anilo'oba' jach talam, especialmente ti' le nivel mecanístico, beetik u le kaambalilo'ob modelo celular jump'éel alternativa k'a'abeto'ob. Te' xook je'ela', k meyajtik jump'éel t.u.m modelo celular utilizando células SH-SY5Y tratadas yéetel PPA utia'al u recapitular le disfunción mitocondrial observada ti' le k'aas k'oja'anilo'obo' neuronales, particularmente le trastornos espectro autismo. U búukinta'al le modelo PPA utia'al u xook le dinámica mitocondrial ti' le neuronas je'el u páajtal u ts'aik visión ti' le etiología le ASD.
K xak'altik u páajtalil u meyaj TEM uti'al u yila'al u k'eexpajal u morfología le mitocondria. Jach k'a'anan u ya'ala'ale' TEM k'a'ana'an u meyaj belil uti'al u maximizar u eficacia. U preparación le crio-especímenes ku cha'antik jump'éel ma'alo'ob conservación le ba'ax neuronales yo'osal u fijación simultáneamente componentes celulares yéetel xu'ulsiko'ob le formación artefactos34. Je'el bix le je'ela', k ilik u le células SH-SY5Y bey neuronas yaan ka'ach orgánulos subcelulares intactos yéetel mitocondrias alargadas (Fig. 1a). Le je'ela' ku ye'esik u utilidad le kaambalilo'ob preparación criogénica utia'al u xook le morfología mitocondrial ti' modelos u células neuronales. Kex le mediciones cuantitativas ku críticas utia'al u análisis objetivo ti' le datos TEM, láayli' mina'an mix jump'éel éejenil yóok'ol ba'ax parámetros específicos k'a'abéet u P'iis utia'al u confirmar cambios morfológicos mitocondriales. K'oja'ano'obo' ti' jump'éel nuxi' meyaj ku u xook ku séen examinado cuantitativamente le morfología mitocondrial17,31,32, desarrollamos jump'éel tubería análisis wíimbala' mitocondrial automatizada ku P'iis waxak parámetros morfológicos, es decir: yo'osal, yo'osal2, relación bey, perímetro, circularidad, grado , metros Feret. yéetel wóolis.
ichil leti'obe', PPA tu xu'ulsaj significativamente yo'osal 2, yo'osal, perímetro, yéetel metros Feret (Fig. 1b-e). Le je'ela' tu ye'esaj u le mitocondrias ku suutikuba'ob asab mejen yéetel asab redondeadas, ba'ax le consistente yéetel xook anteriores ku ye'esik jump'éel disminución ti' le yo'osal mitocondrial ka' 72 horas u estrés mitocondrial inducido tumen PPA30. Le k'iino'oba' yáantajo'ob morfológicas páajtal indicar fisión mitocondrial, jump'éel tuukula' k'a'abéet utia'al u secuestrar componentes dañados ti' le páawo'ob mitocondrial utia'al u fomentar u degradación yo'osal le mitofagia35,36,37. Ba'axten otra parte, le disminución ti' le Buka'aj chúumuk mitocondrial je'el u páajtal u asociada yéetel aumento le biogénesis, ku resulta ti' le formación mejen mitocondrias nacientes. U ya'abtal le fisión wa le biogénesis ku chíikbesik jump'éel núukik compensatoria uti'al u mantener le mitosis xu'ullsa'al le estrés mitocondrial. Ba'ale', u yéemel u nojochtal le mitocondrias, u k'astal le fusión, wa uláak' condiciones ma' táan u béeytal u excluidas.
Kex le máak ka'anal resolución creadas tumen TEM permiten le determinación características morfológicas ti' le nivel mitocondrias individuales, le método produce instantáneas bidimensionales ti' jump'éel chéen ch'aaj ti' le k'iin. Utia'al u xook le respuestas dinámicas ti' le estrés metabólico, k manchado le mitocondrias yéetel TMRE yéetel utilizamos microscopía lapso k'iin yéetel análisis MEL, ku cha'antik visualización 3D u ka'anal rendimiento cambios ti' le páawo'ob mitocondrial ichil le k'iin33,38. K ilik cambios sutiles ba'ale' significativos ti' le dinámica mitocondrial yáanal estrés PPA (Fig. 2). Ti' 3 mM, le meyaj ku k'inbesajo'ob fisión aumentó significativamente, ka' jo'op' u k'inbesajo'ob fusión permanecieron le k'iino' je'el xano' bey ti' le kaambalil yo'osal. Juntúul aumento ti' le meyaj ku k'inbesajo'ob u fisión yéetel fusión bin u observado ti' 5 mM PPA, ba'ale' le k'iino'oba' cambios bino'ob aproximadamente proporcionales, sugiriendo u le cinética fisión yéetel fusión alcanzan equilibrio ti' concentraciones asab altas (Fig. 2b). Le volumen mitocondrial chúumuk ma' k'expajal ti' 3 yéetel 5 mM PPA, ku ye'esik u integridad le páawo'ob mitocondrial bin conservada (Fig. 2d). Le je'ela' ku ye'esik u páajtalil le páawo'ob mitocondriales dinámicas utia'al u núukik le estrés metabólico leve utia'al u mantener yéetel eficacia le homeostasis xma' causar fragmentación le páawo'ob. Ti' 3 mM PPA, le aumento ti' le fisión jach suficiente utia'al u promover le transición ti' jump'éel túumben equilibrio, ba'ale' k'a'abéet jump'éel remodelación cinética asab profunda ti' núukik le estrés inducido tumen concentraciones asab altas ti' PPA.
Le meyaj ku mitocondrias aumentó ti' ambas concentraciones estrés PPA, ba'ale' le volumen mitocondrial chúumuk ma' k'expajal significativamente (Fig. 2c). Le je'ela' je'el u páajtal u yúuchul tumen u ya'abtal le biogénesis wa u ya'abtal le divisióno'; ba'ale', wa mina'an jump'éel disminución significativa ti' le volumen mitocondrial promedio, jach asab probable u aumenta le biosíntesis. Ba'ale', le datos ti' le yoochel 2 ku yáanta'al u yaantal ka'ap'éel mecanismos compensatorios: jump'éel aumento ti' le meyaj ku k'inbesajo'ob fisión, consistente yéetel le regulación superior ti' le fisión mitocondrial, yéetel jump'éel aumento ti' le meyaj ku k'inbesajo'ob, consistente yéetel le biogénesis mitocondrial. Tu ts'ooke', le compensación dinámica uti'al le estrés leve je'el u páajtal u consistir ti' procesos simultáneos ku táakpajalo'ob fisión, fusión, biogénesis yéetel mitofagia. Kex le autores anteriores ts'o'ok u demostrado u PPA mejora le mitosis30,39 yéetel le mitofagia29, proporcionamos pruebas utia'al u remodelación le fisión mitocondrial yéetel le dinámica fusión ti' núukik le PPA. Le k'iino'oba' datos confirman le cambios morfológicos observados tumen TEM yéetel proporcionan asab visión ti' le mecanismos asociados yéetel le disfunción mitocondrial inducida tumen PPA.
Tuméen mix TEM mix MEL análisis proporcionó prueba directa ti' le mecanismos regulatorios genéticos subyacentes ti' le cambios morfológicos observados, examinamos le expresión ARN ti' le genes involucrados ti' le metabolismo mitocondrial, biogénesis yéetel dinámica. Le proto-oncogeno cMYC jach jump'éel factor transcripción ku táakpajal ti' le regulación mitocondrias, glucólisis, aminoácidos yéetel metabolismo ácidos grasos40. Beyxan, cMYC leti'e' k'ajóolta'an tumen u regular le expresión naats'il ti' 600 genes mitocondriales involucrados ti' le transcripción mitocondrial, traducción yéetel montaje complejo, incluyendo NRF1 yéetel TFAM41. NRF1 yéetel TFAM ku ka'ap'éel reguladores centrales ti' le mitosis, ku meyajo'ob abajo de PGC-1α utia'al u activar le replicación mtDNA. Le bejo' ku activa tumen le señalización cAMP yéetel AMPK yéetel jach sensible ti' le gasto energía yéetel le estrés metabólico. Xan examinamos NFE2L2, jump'éel regulador redox ti' le biogénesis mitocondrial, utia'al determinar wa le táanil le PPA je'el u páajtal u mediados tumen le estrés oxidativo.
Kex le expresión NFE2L2 ma' k'expajal, k encontramos jump'éel disminución consistente dependiente ti' le dosis ti' le expresión cMYC, NRF1 yéetel TFAM ka' 24 h u Ts'a'akal yéetel 3 mM yéetel 5 mM PPA (Fig. 3a-c). U t'okik u expresión cMYC ts'o'ok u ya'ala'al bey jump'éel núukik ti' le estrés mitocondrial42, yéetel tu contrario, u t'okik u expresión cMYC je'el u páajtal u causar disfunción mitocondrial tumen le remodelación metabolismo mitocondrial, conectividad páawo'ob, yéetel polarización membrana43. Jach jats'uts, cMYC xan táakpajal ti' le regulación le fisión mitocondrial yéetel le fusión42,43 yéetel u k'ajóolta'an tumen ya'abtal le fosforilación DRP1 yéetel le localización mitocondrial ichil le división celular44, bey mediar le remodelación morfológica mitocondrial ti' le células na' neuronales45. Jach jaajile', le fibroblastos deficientes ti' cMYC ku ye'esik jump'éel Buka'aj mitocondrial reducido, consistente yéetel le cambios inducidos tumen le estrés PPA43. Le k'iino'oba' datos ilustran jump'éel relación ts'áik Ba'ale' láayli' ma' clara ichil cMYC yéetel le dinámica mitocondrial, proporcionando jump'éel objetivo ts'áik utia'al u xook futuros ti' le remodelación inducida tumen estrés PPA.
U xu'ulul NRF1 yéetel TFAM ku bin yéetel u meyaj cMYC bey jump'éel activador transcripcional jach k'a'anan. Le k'iino'oba' datos xan ku consistentes yéetel xook anteriores ti' células k'ak'as k'oja'anil cáncer u colon humano ku ye'esik u PPA redujo le expresión mRNA NRF1 ti' 22 horas, ku bin asociado yéetel le agotamiento ATP yéetel aumento ROS46. Le k'iino'oba' autores xan informaron u expresión TFAM aumentó ti' 8.5 horas Ba'ale' suut ti' le niveles línea base ti' 22 horas. U jela'anil, Kim et al. (2019) tu ye'esaj u expresión le mRNA TFAM bin significativamente disminuida ka' 4 h u estrés PPA ti' células SH-SY5Y; ba'ale', ka' 72 horas, le expresión proteína TFAM bin significativamente aumentada yéetel meyaj ku copias mtDNA bin significativamente aumentada. Beyo', le disminución ti' le meyaj ku genes biogénesis mitocondrial ku observamos ka' 24 horas ma' excluye u posibilidad u le aumento ti' le meyaj ku mitocondrias ku asocia yéetel le activación biogénesis ti' ti'its k'iin anteriores. Xook ts'o'ok u ye'esik u PPA significativamente upregula PGC-1α mRNA yéetel proteína ti' células SH-SY5Y ti' 4 horas 30 minutos, ka' jo'op' u le ácido propiónico mejora le biogénesis mitocondrial ti' le hepatocitos becerro yo'osal PGC-1α ti' 12 horas 39 minutos. Jach jats'uts, PGC-1α ma' chéen leti' jump'éel regulador transcripcional Jun ti' NRF1 yéetel TFAM, ba'ale' xan u demostrado u regula le actividad MFN2 yéetel DRP1 yo'osal u regulación le fisión yéetel le fusión47. Tu láakal, le je'ela' ku ye'esik le estrecho acoplamiento mecanismos ku regulan le respuestas compensatorias mitocondriales inducidas tumen PPA. Beyxan, k datos ku ye'esik jump'éel disregulación significativa ti' le regulación transcripcional ti' le biogénesis yéetel le metabolismo yáanal estrés PPA.
Le genes STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 yéetel DRP1 ku táakpajalo'ob ichil le reguladores centrales ti' le fisión mitocondrial, fusión yéetel dinámica37,48,49. Yaan ya'ab uláak' genes ku táakpajalo'ob ti' le dinámica mitocondrial, ba'ale', STOML2, OPA1 yéetel MFN2 ts'o'ok u Kaxa'antbil ka'ache' u metilados diferencialmente ti' le cohortes ASD,16 yéetel ya'ab xook independientes ts'o'ok u informado cambios ti' le k'iino'oba' factores transcripción ti' núukik le estrés mitocondrial50,51. 52. Le expresión OPA1 yéetel STOML2 bin significativamente reducida tumen 3 mM yéetel 5 mM Ts'a'akal PPA (Fig. 3e, f). OPA1 jach juntúul le reguladores clásicos ti' le fusión mitocondrial yo'osal le interacción directa yéetel MFN1 yéetel 2 yéetel desempeña jump'éel ju'un ti' le remodelación cristae yéetel le morfología mitocondrial53. Le meyaj ku beetik STOML2 ti' le dinámica mitocondrial ma' jach chika'an, ba'ale' le evidencia ku ya'alik u báaxal jump'éel ju'un ti' le fusión mitocondrial, biogénesis yéetel mitofagia.
STOML2 táakpajal ti' le mantenimiento le acoplamiento respiratorio mitocondrial yéetel formación complejos tsolokbal respiratoria54,55 yéetel u demostrado u alterar profundamente le yáantajo'ob metabólicas ti' le células cancerosas56. Xook ts'o'ok u demostrado u STOML2 promueve le potencial membrana mitocondrial yéetel le biogénesis yo'osal le interacción yéetel BAN yéetel cardiolipina 55, 57, 58. Ku ts'o'okole', xook independientes ts'o'ok u demostrado u le interacción ichil STOML2 yéetel PINK1 regula mitofagia59,60. K'a'ana'an u ya'ala'ale', STOML2 ts'o'ok u ya'ala'al u interactúa Jun yéetel ka estabilizar MFN2 yéetel xan desempeña jump'éel ju'un Páaybe'en ti' le estabilización isoformas OPA1 chowaktako'ob yo'osal u inhibición le proteasa responsable ti' le degradación OPA153,61,62. Le reducción ti' le expresión STOML2 observada ti' le reacciones PPA je'el u meentik u le k'iino'oba' proteínas fusión asab susceptibles ti' le degradación yo'osal le vías dependientes ti' le ubiquitina yéetel le proteasoma48. Kex ma' jach chika'an u meyaj STOML2 yéetel OPA1 ti' le núukik dinámica ti' PPA, le expresión disminuida ti' le k'iino'oba' genes fusión (yoochel 3) je'el u páajtal u interrumpir le equilibrio ichil le fisión yéetel le fusión yéetel conducir ti' le disminución Buka'aj mitocondrial (yoochel 3). 1).
Ba'axten otra parte, le expresión proteína OPA1 permaneció xma' cambios ka' 24 h, ka' jo'op' u le mRNA yéetel le niveles proteínas MFN1, MFN2 wa DRP1 ma' k'expajal significativamente ka' u Ts'a'akal PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Le je'ela' je'el u páajtal u indicar u mina'an cambios ti' le regulación le k'iino'oba' factores involucrados ti' le fusión yéetel fisión mitocondrial. Ba'ale', k'a'ana'an u ya'ala'ale' jujuntúulal ti' le kanp'éel genes xan u regula tumen modificaciones posttranscripcionales (PTMs) ku controlan le actividad proteína. OPA1 yaan ti' Ukp'éel variantes u empalme alternativas ku proteolíticamente hendidas ti' le mitocondrias utia'al u producir ka'ap'éel isoformas distintas 63 . Le equilibrio ichil isoformas chowaktako'ob yéetel kóomtak tu ts'ook instancia determina le ju'uno' OPA1 ti' le fusión mitocondrial yéetel mantenimiento le páawo'ob mitocondrial64. U meyaj DRP1 ku jets'ik tumen le fosforilación proteína quinasa II (CaMKII) dependiente ti' calcio leti' calmodulina, ka' jo'op' u le degradación DRP1 ku jets'ik tumen le ubiquitinación yéetel le SUMOilación65. Tu ts'ooke', DRP1 yéetel MFN1 leti' 2 ku GTPasas, bey u le actividad je'el u páajtal u influenciada tumen le tasa producción GTP ti' le mitocondrias 66 . Le o'olale', kex u expresión le k'iino'oba' proteínas permanece constante, le je'ela' ma' je'el reflejar actividad wa localización proteína ma' k'expajal67,68. Jach jaajile', le repertorios proteínas PTM existentes tu menudo ku meyajtiko'ob bey le yáax internet ichil defensa responsable u mediar le respuestas estrés agudo. Tu táan le estrés metabólico moderado ti' k bix, jach probable u PTM promueve le asab actividad le proteínas fusión yéetel fisión utia'al u restaurar suficientemente le integridad mitocondrial xma' requerir activación adicional ti' le k'iino'oba' genes ti' le nivel mRNA wa proteína.
Tu láakal, le datos anteriores destacan le regulación compleja yéetel dependiente ti' le k'iin ti' le morfología mitocondrial yéetel le desafíos u elucidar le k'iino'oba' mecanismos. Utia'al u xak'alta'al u expresión le gen, yáax k'a'abéet u identificar genes objetivo específicos ti' le bejo'. Ba'ale', k datos ku ye'esik u le genes ti' le bak'paach bejo' ma' responden u bak'paach bix ken ti' le bak'paach estrés. U jaajile', xook máaniko'ob ts'o'ok u ye'esik u jejeláas genes ti' le bak'paach beejil je'el u páajtal u ye'esik jejeláas perfiles núukik temporal30,46. Beyxan, yaan mecanismos post-transcripcionales complejos ku k'askúuntik le relación ichil le transcripción yéetel le función genética. Le xook proteómicos je'el u páajtal u ts'aik jump'éel visión yóok'ol le impacto le PTMs yéetel le función proteínas, ba'ale' xan plantean desafíos incluyendo métodos u t'okik rendimiento, altas relaciones señal-ruido, yéetel k'aak'as resolución.
Ti' le contexto, xook morfología mitocondrial utilizando TEM yéetel MEL yaan nuxi' potencial utia'al u abordar k'áat chi'oba' fundamentales yóok'ol le relación ichil le dinámica mitocondrial yéetel le función yéetel bix le ba'ala' influye ti' le k'oja'anil. Le ba'ax jach k'a'anane', TEM ku ts'aik jump'éel método directo uti'al u p'iis le morfología mitocondrial bey jump'éel ch'aaj final convergente ti' le disfunción mitocondrial yéetel le dinámica51. MEL xan proporciona jump'éel método directo utia'al u visualizar le k'inbesajo'ob fisión yéetel fusión ti' jump'éel entorno celular tridimensional, ku cha'antik cuantificación le remodelación mitocondrial dinámica páajtal ti' le ausencia cambios ti' le expresión genética33. Te'ela' k destacamos u utilidad le kaambalilo'ob ti' imágenes mitocondriales ti' le k'aas k'oja'anilo'obo' mitocondriales p'iskaambal. Le k'oja'anilo'oba' ku chíikpajal tumen estrés metabólico leve crónico ku chíikpajal tumen jump'éel sutil remodelación ti' le redes mitocondriales kúuchil tu p'ataji' mitocondriales agudos. Ba'ale', le compensación mitocondrial k'a'abeto'ob uti'al u mantener le mitosis yáanal estrés crónico yaan ti' consecuencias funcionales profundas. Ti' le contexto le neurociencia, jump'éel ma'alo'ob comprensión le k'iino'oba' mecanismos compensatorios je'el u páajtal u ts'aik a'alajil t'aan Páaybe'en yóok'ol le neuropatología pleiotrópica asociada yéetel le disfunción mitocondrial.
Tu ts'ooke', k datos ku ye'esik u utilidad le kaambalilo'ob u imagen utia'al u entender le consecuencias funcionales ti' le interacciones complejas ichil le expresión genética, modificaciones proteínas, yéetel actividad proteína ku controlan le dinámica mitocondrial neuronal. Utilizamos PPA utia'al u modelar le disfunción mitocondrial ti' jump'éel bix u células neuronales utia'al u náajaltik visión ti' le componente mitocondrial ti' le ASD. Le células SH-SY5Y tratadas yéetel PPA mostraron cambios ti' le morfología mitocondrial: le mitocondrias ku suutikuba'ob mejen yéetel wóoliso', ka cristae bino'ob k'aas definidas ken u observaron tumen TEM. Le análisis MEL ku ye'esik le k'eexo'oba' ku yúuchul concomitantemente yéetel jump'éel aumento ti' le k'inbesajo'ob fisión yéetel fusión utia'al u mantener le páawo'ob mitocondrial ti' núukik le estrés metabólico leve. Beyxan, PPA ku k'askúuntik u regulación transcripcional ti' le metabolismo mitocondrial yéetel le homeostasis. K identificamos cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, yéetel OPA1 bey reguladores mitocondriales clave interrumpidos tumen le estrés PPA yéetel páajtal báaxal jump'éel ju'un ti' le mediación cambios inducidos tumen PPA ti' le morfología yéetel le función mitocondrial. K'a'abéet u beeta'al xook ku taal u k'iini' uti'al u ma'alob caracterizar le cambios temporales inducidos tumen PPA ti' le expresión genética yéetel le actividad proteína, localización yéetel modificaciones post-translacionales. K datos destacan le complejidad yéetel le interdependencia le mecanismos regulatorios ku median le núukik estrés mitocondrial yéetel demostran le utilidad TEM yéetel uláak' kaambalilo'ob u imagen utia'al u xook mecanísticos asab dirigidos.
Le línea celular SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) bin u adquirida ti' Sigma-Aldrich. Le células SH-SY5Y bino'ob cultivadas ti' le mezcla nutrientes u chúumuk leti' F-12 u Eagle modificado u Dulbecco (DMEM leti' F-12) yéetel L-glutamina (SC09411, ScienCell) ti' matraces 25 cm2 complementados yéetel 20 ti chúumuk suero bovino fetal (FBS) (1930, 1936) yéetel Scienfico 1% penicilina-estreptomicina (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ti' 37 °C, 5% CO2. Le células bino'ob subcultivadas ti' le 80% confluencia utilizando 0.05% tripsina-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugadas ti' 300 g yéetel chapadas ti' jump'éel densidad yan 7 × 105 células leti' ml. Tuláakal le experimentos ku beeta'al ti' células SH-SY5Y ma' diferenciadas ichil le pasajes 19-22. PPA ku ts'aik bey NaP. Disolver juuch'bil NaP (CAS No. 137-40-6, fórmula química C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) ti' ja' chokoj MilliQ ti' jump'éel concentración 1 M yéetel almacenar ti' 4 ° C. Tu k'iinil u ts'a'akal, diluir le solución yéetel 1 M PPA u 3 mM yéetel 5 mM PPA ti' chúumuk libre u suero (DMEM leti' F-12 yéetel L-glutamina). Le concentración Ts'a'akal utia'al tuláakal le experimentos ma' bin PPA (0 mM, kaambalil yo'osal), 3 mM, yéetel 5 mM PPA. Le experimentos ku beeta'al ti' Ba'axten lo bey óoxp'éel réplicas biológicas.
Le células SH-SY5Y bino'ob u sembradas ti' matraces 25 cm5 ti' jump'éel tasa 5.5 × 105 células leti' ml yéetel cultivadas ichil 24 horas. Le Ts'a'akal PPA ku ts'áabal ti' le matraz bey ma' 24 h u incubación. Much'aba pellets celulares je'ela' protocolos subcultivo u wa'ak'al mamífero normal (descrito ka'anal). K'a' suspender le pelotilla celular ti' 100 μl 2.5% glutaraldehído, 1 × PBS yéetel almacenar ti' 4 ° C tak ka procesamiento. Le células SH-SY5Y bino'ob brevemente centrifugadas utia'al u pellet le células yéetel tselik 2.5 ti chúumuk glutaraldehído, 1 × solución PBS. Suspender le sedimento ti' jump'éel gel agarosa 4% preparado ti' ja' destilada (le relación agarosa yéetel volumen sedimento jach 1:1). U xéet' agarosae' ku ts'a'abal yóok'ol rejillas yóok'ol placas planas yéetel ku ts'a'abal yéetel 1-hexadeceno bey ma' u congelar u ka'anal presión. Le muestras bino'ob congeladas ti' 100% acetona tikin ti' -90°C ichil 24 horas. Le temperatura bin túun elevada u -80 ° C ka jump'éel solución 1 ti chúumuk tetróxido osmio yéetel 0.1 ti chúumuk glutaraldehído ku añadió. Le muestras bino'ob almacenadas ti' -80°C ichil 24 horas. Ka' lela', le temperatura bin u ya'abtal jujump'íitil tak temperatura ambiente ichil ya'ab k'iino'ob: tak – 80 °C tak – 50 °C ichil 24 horas, tak – 30 °C ichil 24 horas, tak – 10 °C ichil 24 horas yéetel finalmente tak temperatura ambiente. téemperatura.
Ka' u preparación criogénica, le muestras bino'ob impregnadas yéetel u yiits yéetel jaatso'ob ultrafinas (∼100 nm) bino'ob hechas utilizando jump'éel ultramicrotomo Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Le jaatso'obo' bino'ob manchadas yéetel 2% acetato uranilo yéetel citrato plomo. Le muestras bino'ob observadas utilizando jump'éel microscopio electrónico u transmisión FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (ka'ache' FEI), Eindhoven, Países Bajos) operando ti' 200 kV (transmisor Lab6) yéetel juntúul cámara CCD Gatan (Gatan, Reino Unido) equipada yéetel juntúul filtro energía Tridiem.
Ti' Amal réplica técnica, Ba'axten lo bey 24 máak chéen célula bino'ob adquiridas, utia'al jump'éel total u 266 máak. Tuláakal le oochelo'obo' bino'ob analizadas utilizando le macro Región u k'ana'an ju'uno'ob (ROI) yéetel le macro Mitocondria. Le macro mitocondrial ku basa ti' métodos publicados17,31,32 yéetel ku cha'antik procesamiento tumen lotes semiautomatizado u máak TEM ti' Fiji leti' ImageJ69. Ti' jump'éel pocos t'aano'ob: le wíimbala' ku invierte yéetel invertida utilizando resta u ju'unil tu'ux yaan wóoliso' rodante (60 píxeles radio) yéetel juntúul filtro paso banda FFT (utilizando 60 yéetel 8 píxeles límites superiores yéetel inferiores respectivamente) yéetel supresión internet ichil verticales yéetel juntúul ti' máansaj óolal ti' le orientación ti' le 5 ti chúumuk. Le wíimbala' procesada ku umbral automáticamente utilizando jump'éel algoritmo entropía máxima yéetel ku genera jump'éel máscara binaria. Le regiones wíimbala' asociadas yéetel ROIs seleccionados manualmente ti' máak TEM crudas bino'ob extraídas, caracterizando mitocondrias yéetel excluyendo le membrana plasmática yéetel uláak' regiones ka'anal contraste. Utia'al Amal ROI extraído, partículas binarias asab nukuch u 600 píxeles bino'ob analizadas, ka yo'osal u partícula, perímetro, ejes mayores yéetel menores, metros Feret, redondez, yéetel circularidad bino'ob medidos utilizando le noj medición incorporadas ti' Fiji leti' ImageJ. Je'el bix Merrill, Flippo, yéetel Strack (2017), yo'osal 2, relación bey partícula (relación bak'pach noj bejo' u menor), yéetel factor beyo' (FF) bino'ob calculados ti' le k'iino'oba' datos, tu'ux FF = perímetro 2 leti' 4pi x yo'osal. U tsoolil le fórmula paramétrica ku páajtal kaxtik ti' Merrill, Flippo, yéetel Strack (2017). Le macros mencionados táan disponibles ti' GitHub (wil Declaración u disponibilidad datos). Tu chúumuk, yan 5.600 partículas bino'ob analizadas tumen Ts'a'akal PPA, utia'al jump'éel total u yan 17.000 partículas (datos ma' u muestran).
Le células SH-SH5Y bino'ob colocadas ti' platos cultivos 8 cámaras (ThermoFisher, #155411) utia'al u permitir le adherencia ichil áak'ab ka tu láak' incubaron yéetel TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) yéetel Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, #155411). boon. Le oochelo'obo' bino'ob adquiridas utilizando láseres 405 nm yéetel 561 nm yóok'ol jump'éel entorno 10 min, ka máak crudas bino'ob adquiridas bey z-stacks ku ya'alik 10 micrografías wíimbala' yéetel paso az u 0.2 μm ichil fotogramas wíimbala' ti' 12 ti'its k'iin posteriores. Le oochelo'obo' bino'ob recogidas utilizando jump'éel plataforma super-resolución Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) utilizando jump'éel lente LCI Plan Apochromate 100x leti' 1.4 Oil DIC M27. Le oochelo'obo' bino'ob analizadas ti' ImageJ utilizando jump'éel tubería descrita ka'ache' yéetel le plugin ImageJ utia'al u P'iis k'inbesajo'ob fusión yéetel fisión, meyaj ku promedio u ba'ax mitocondriales, yéetel volumen mitocondrial chúumuk tumen cell33. Le macros MEL táan disponibles ti' GitHub (wil Declaración u disponibilidad datos).
Le células SH-SY5Y bino'ob cultivadas ti' placas seis-well ti' jump'éel densidad 0.3 × 106 células leti' mL ichil 24 horas bey ma' u Ts'a'akal. ARN bin extraído utilizando le protocolo Quick-RNATM Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) yéetel modificaciones leves: añadir 300 μl u tampón lisis ARN ti' Amal ch'e'eno' bey ma' eliminación yéetel lisis Amal muestra bey paso final yéetel 30 μl u elución DNase leti' RNase. -ja' libre. Tuláakal le muestras bino'ob comprobadas utia'al u cantidad yéetel calidad utilizando jump'éel espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 UV-Vis. Le proteína total ti' le lisados ​​celulares u obtuvo utilizando 200 μl tampón lisis RIPA, ka concentración proteína bin cuantificada utilizando le ensayo proteína Bradford70.
U síntesis le ADNc u beeta'al yéetel le TetroTM cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) bin u t'aano'ob le fabricante yéetel Jayp'éel modificaciones. cDNA bin sintetizado ti' reacciones 20-μl utilizando 0.7 u 1 μg u ARN total. Le cebadores bino'ob seleccionados ti' ju'uno'ob publicados ka'ache' 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabla S1) yéetel le sondas acompañantes bino'ob diseñadas utilizando le nu'ukula' PrimerQuest u Integrated DNA Technologies. Tuláakal le genes k'ana'an ju'uno'ob bino'ob normalizados ti' le gen B2M nuclear. Le expresión genética ti' STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC yéetel OPA1 bin u P'iis tumen RT-qPCR. Le mezcla noj bejo' incluyó LUNA Taq polimerasa (M3003L, New England Biolabs), 10 μM cebadores tak táanil yéetel tak paachil, cDNA, yéetel ja' grado PCR utia'al u ts'aik jump'éel volumen final u 10 μL utia'al Amal reacción. U expresión le genes división yéetel fisión (DRP1, MFN1 leti' 2) bin u P'iis utilizando ensayos multiplex TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) bin utilizado bin le t'aano'ob le fabricante yéetel modificaciones menores. Le multiplex RT-qPCR master mix analte'obo' yaan 1X LUNA Taq polimerasa, 10 μM cebadores tak táanil yéetel tak paachil, 10 μM sonda, cDNA, yéetel ja' grado PCR, ts'áaik tumen resultado jump'éel volumen final u 20 μL utia'al Amal reacción. RT-qPCR u beeta'al yéetel Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—serial number: R0618110). Le condiciones u ciclismo ku muestran ti' le cuadro S1. Tuláakal le muestras cDNA bino'ob amplificadas ti' triplicado yéetel jump'éel curva estándar bin generada utilizando jump'éel serie diluciones diez veces. Le extremos ti' muestras triplicadas yéetel desviación estándar u umbral ciclo (Ct) >0.5 bino'ob eliminados ti' le análisis utia'al u asegurar le reproducibilidad datos30,72. Le expresión genética relativa bin u calculada utilizando le método 2-ΔΔCt79.
Muestras proteínas (60 μg) bino'ob mezcladas yéetel tampón kuuch Laemmli ti' jump'éel relación 2:1 yéetel ejecutaron ti' jump'éel gel proteína incoloro 12 ti chúumuk (Bio-Rad #1610184). Le proteínas bino'ob transferidas ti' jump'éel membrana PVDF (fluoruro de polivinilideno) (#170-84156, Bio-Rad) utilizando le yaan Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Le membrana bin bloqueada yéetel incubada yéetel le anticuerpos primarios apropiados (OPA1, MFN1, MFN2, yéetel DRP1) (diluido 1:1000) ichil 48 horas, seguido tumen incubación yéetel anticuerpos p'iskaambal (1:10.000) ichil 1 p'isib. Le membranas bino'ob túun imágenes utilizando Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) yéetel registradas utilizando juntúul t.u.m Bio-Rad ChemiDoc MP. ImageLab versión 6.1 bin utilizado utia'al u análisis Western blot. Le gel áantajil yéetel le blot ku ye'esik ti' le yoochel S1. A'alajil t'aan ti' anticuerpos ku ts'aik ti' le tabla S2.
Le conjuntos datos ku presentan bey le promedio yéetel le ba'alo' estándar ti' le promedio (SEM) Ba'axten lo bey óoxp'éel muestras independientes. Le conjuntos datos bino'ob u probados utia'al u normalidad utilizando le prueba Shapiro-Wilks (a menos u uláak' ba'ax ku ya'alik) bey ma' asumir jump'éel distribución gaussiana yéetel desviaciones estándar iguales yéetel proceder yéetel le análisis. Beyxan ti' kaambalilo'ob análisis le conjunto datos utilizando Fisher MEL LSD (p < 0.05), ANOVA unidireccional (Ts'a'akal vs. kaambalil yo'osal promedio), yéetel prueba comparación múltiple u Dunnett utia'al u determinar le significación (p < 0.05). Le ba'alo'ob p significativas ku ye'esik ti' le gráfico bey *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Tuláakal le análisis estadísticos yéetel gráficos bino'ob realizados yéetel generados utilizando GraphPad Prism 9.4.0.
Fiji leti' ImageJ macros utia'al u análisis wíimbala' TEM táan disponibles públicamente ti' GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Le macro Mitocondrial Event Locator (MEL) táan disponible públicamente ti' GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM yéetel Vijaya A. Mitocondrias: reguladores maestros ti' le metabolismo, homeostasis, estrés, envejecimiento yéetel epigenética. indonesio. Ciencia Biomédica. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfunción mitocondrial multifacética ti' le esquizofrenia, complejo I bey jump'éel posible objetivo patológico. Esquizofrenia. nu'ukulo'ob. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. yéetel Beal, MF Disfunción mitocondrial ti' le k'oja'anil Parkinson. J. Neuroquímica. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG yéetel Mehta V. Mitocondrias estresadas: objetivos u invasión ti' le k'oja'anil Alzheimer. Mitocondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF yéetel Ferreira GK Mitocondrias yéetel le ta ts'o'omej: bioenergética yéetel asab. Neurotoxinas. nu'ukulo'ob. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitocondrias pleiotrópicas: u impacto le mitocondrias ti' le ma'alo'ob neuronal yéetel le k'oja'anil. J. Neurociencia. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. yéetel Morais, VA Biogénesis mitocondrial ti' le neuronas: bix yéetel tu'ux. internacionalidad. J. Mohr. le cienciao'. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. yéetel Zhao, J. Regulación ti' le dinámica mitocondrial ti' le mamíferos: oportunidades yéetel desafíos. táanil. endocrino. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. yéetel Slack, RS Dinámica mitocondrial ti' le regulación le neurogénesis: tak le ma'alo'ob u ta ts'o'omej nojoch máaktal. mu'uk'a'ankúun. dinámico. 247, 47–53 (2018).