Le artículo jach jump'éel nu'ukulil le chun tuukulo' investigación "Ma'alo'obkíinsiko'ob u resistencia le legumbres ti' le patógenos yéetel le plagas", wil tuláakal le 5 artículos
Le aj nu'uktaj causal ti' le k'oja'anil páak'alo' fúngica necrosis Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary meyajtiko'ob jump'éel estrategia ya'ab k'oja'ano'ob niveles utia'al u infectar jejeláas paak'alo'ob huéspedes. Le xooko' ku ts'áaik u búukinta'al le diamina L-ornitina, jump'éel aminoácido ma' proteína ku estimula le síntesis uláak' aminoácidos k'a'abeto'ob, bey jump'éel estrategia gestión alternativa yo'osal u ma'alo'obkíinsiko'ob le respuestas moleculares, fisiológicas yéetel bioquímicas u Phaseolus vulgaris L. ti' le moho sak causado tumen Pseudomonatio scleromonas. Le experimentos in vitro tu ye'eso'ob u L-ornitina inhibió significativamente le tuméen micelial u S. pyrenoidosa ti' jump'éel bix ken dependiente ti' le dosis. Ku ts'o'okole', je'el u páajtal u xu'ulsiko'ob significativamente u gravedad le moho sak yáanal condiciones invernadero. Beyxan, L-ornitina estimuló tuméen le páak'alo'obo' tratadas, indicando u le concentraciones probadas ti' L-ornitina ma' bino'ob fitotóxicas utia'al le páak'alo'obo' tratadas. Beyxan, L-ornitina tu beetaj u ya'abtal u ye'esajil le antioxidantes ma' enzimáticos (fenólicos solubles totales yéetel flavonoides) yéetel le antioxidantes enzimáticos (catalasa (CAT), peroxidasa (POX), yéetel polifenol oxidasa (PPO)), ka tu ya'abtal u ye'esajil óoxp'éel genes relacionados yéetel le antioxidantes (CAT1, PVGRAT, yéetel PVD). Beyxan, le análisis in silico tu ye'esaj u yaantal jump'éel proteína putativa u oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH) ti' le genoma S. sclerotiorum, ba'ax ka'ach jach similar ti' le proteínas oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH) u Aspergillus fijiensis (AfOAH) yéetel Penicillium Penicillium. (PlOAH) ti' términos u análisis funcional, dominios conservados, yéetel topología. Jach jats'uts, u ts'áabal L-ornitina ti' le caldo dextrosa patata (PDB) chúumuk disminuyó significativamente le expresión gen SsOAH ti' le micelios S. sclerotiorum. Bey xan, le ka'anatako'ob exógena ti' L-ornitina disminuyó significativamente le expresión gen SsOAH ti' micelios fúngicos recogidos ti' paak'alo'ob tratadas. Tu ts'ooke', u ka'anatako'ob L-ornitina disminuyó significativamente le secreción ácido oxálico ti' le chúumuk PDB yéetel le' infectadas. Tu ts'ooke', L-ornitina ku báaxal jump'éel ju'un k'a'anan ti' le mantener le noj redox bey ma'alo'obkíinsiko'ob u núukik defensa le páak'alo'obo' infectadas. Ya'ala'al máaxo'ob máano'ob le xooko' je'el wáantik ti' le ma'alo'ob métodos innovadores, respetuosos yéetel le ka'a jeets' utia'al u controlar le moho sak yéetel mitigar u impacto ti' le producción habas yéetel uláak' cultivos.
Le moho sak, causado tumen le hongo necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, leti' jump'éel k'oja'anil devastadora, reductora u rendimiento ku plantea jump'éel grave amenaza utia'al u producción global u habas (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum jach juntúul le patógenos páak'alo'obo' hongos transmitidos tumen le lu'umo' asab talam u controlar, yéetel juntúul amplia gama huésped u yóok'ol 600 especies páak'alo'obo' yéetel le Buka'aj u ba'al u macerar jáan tejidos huésped ti' jump'éel bix ken ma' específica (Liang yéetel Rollins, 2018). Yáanal condiciones desfavorables, ku máan ti' jump'éel fase crítica ti' u ciclo kuxtal, permaneciendo inactivo ichil chowaktako'ob períodos k'iin bey negro, Chich, ba'ax bey neek' llamadas 'sclerotia' ti' le lu'umo' wa bey crecimientos sak, esponjosos ti' le micelio wa pith tallo le páak'alo'obo' infectadas (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum je'el u páajtal u beetik esclerotia, ba'ax ku cha'ik u kuxtal ti' sikte infectados ichil ya'ab k'iin yéetel u p'áatal ichil le k'oja'anil (Schwartz et al., 2005). Le esclerotia'obo' ayik'alo'ob ti' nutrientes, je'el u páajtal u p'áatal ichil le lu'umo' ichil ya'ab k'iino'ob, yéetel ku meyajtiko'ob bey le inóculo primario uti'al le infecciones posteriores (Schwartz et al., 2005). Yáanal condiciones favorables, le esclerotia germinan yéetel producen esporas iik' ku páajtal infectar tuláakal le pak'chaje' yóok'ol le lu'umo' le páak'alo', incluyendo Ba'ale' ma' limitado ti' loolo'obo', tallos, wa vainas (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum meyajtiko'ob jump'éel estrategia ya'abkach niveles utia'al u infectar u paak'alo'ob huéspedes, implicando jump'éel serie k'inbesajo'ob coordinados tak le germinación esclerotial tak le ma'alo'ob síntomas. Tu káajbale', S. sclerotiorum ku beetik esporas suspendidas (ku k'aaba'tik ascosporas) ti' ba'alo'ob bey hongos ku k'aaba'tik apothecia, ku suuto'ob ti' iik' yéetel ku jóok'ol ti' esclerotia ma' móvil ti' le escombros vegetales infectados (Bolton et al., 2006). Le hongo túun secreta ácido oxálico, jump'éel factor virulencia, utia'al u controlar le pH le pak'o' celular le páak'alo', promover le degradación enzimática yéetel le invasión t'aan (Hegedus yéetel Rimmer, 2005), ka suprimir le ráfaga oxidativa ti' le páak'alo' huésped. Le tuukula' acidificación ku debilitar le pak'o' celular le páak'alo', proporcionando jump'éel entorno favorable utia'al u funcionamiento normal yéetel eficiente ti' le enzimas degradantes u pak'o' celular fúngica (CWDEs), Cha' u le patógeno superar le barrera física yéetel penetrar le tejidos huésped (Marciano et al., 1983). Le ken ts'o'okok u yokol, S. sclerotiorum ku jóok'sik jump'éel meyaj ku CWDEs, bey le poligalactoronasa yéetel le celulosa, ku yáantik u k'i'itpajal ti' le tejidos infectados yéetel causan necrosis tisular. U bin u nojochtal le lesiones yéetel le esteras hifales ku bisik ti' le síntomas característicos ti' le moho sak (Hegedus yéetel Rimmer, 2005). Ichil, le páak'alo'obo' huéspedes reconocen patrones moleculares asociados yéetel le patógenos (PAMPs) yo'osal le receptores reconocimiento patrones (PRRs), desencadenando jump'éel serie k'inbesajo'ob señalización ku finalmente activan le respuestas defensa.
Kex ya'ab ja'abo'ob táan u beeta'al u kanáanta'al le k'oja'anilo'obo', mina'an u germplasma resistente ti' le habao', je'el bix ti' uláak' cultivos comerciales, tuméen u resistencia, supervivencia yéetel adaptabilidad le patógeno. Le beetike', u kanáanta'al le k'oja'anilo'obo' jach talam yéetel k'a'abet jump'éel estrategia integrada yéetel ya'abkach ba'alo'ob ku táakbesik jump'éel combinación ti' le meyajo'ob miatsil, kaambalil yo'osal biológico yéetel fungicidas químicos (O'Sullivan et al., 2021). Le kaambalil yo'osal químico ti' le moho sak jach le asab xoknáalo'obo' tuméen le fungicidas, ka aplicados belil yéetel tu k'iinil correcto, páajtal controlar yéetel eficacia le propagación le k'oja'anil, xu'ulsiko'ob u gravedad le infección, ka minimizar pérdidas rendimiento. Ba'ale', u jach búukinta'al yéetel u jach k'ubik u yóol ti' le fungicidas je'el u beetik u yantal cepas resistentes ti' S. sclerotiorum yéetel yaan u impacto negativo ti' le organismos ma' objetivo, toj óolal le lu'umo' yéetel ma'alobil ja' (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Le o'olale', kaxtik alternativas respetuosas yéetel le ka'a jeets' ts'o'ok u suut jump'éel prioridad superior.
Le poliaminas (PAs), bey putrescina, espermidina, espermina yéetel cadaverina, je'el u páajtal u meyaj bey alternativas prometedoras xu'ullsa'al le patógenos vegetales transmitidos tumen le lu'umo', tune' jaatsatako'ob wa parcialmente xu'ulsiko'ob u búukinta'al fungicidas químicos peligrosos (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Ti' le paak'alo'ob ka'anal, le PAs ku táakpajalo'ob ti' ya'ab procesos fisiológicos incluyendo, Ba'ale' ma' u limitan ti', división celular, diferenciación, yéetel núukik le tensiones abióticas yéetel bióticas (Killiny yéetel Nehela, 2020). Je'el u páajtal u meyajo'ob bey antioxidantes, wáantik u t'o'oxol le especies oxígeno reactivo (ROS), mantener le homeostasis redox (Nehela yéetel Killiny, 2023), inducir genes relacionados yéetel le defensa (Romero et al., 2018), regular jejeláas vías metabólicas (Nehela yéetel Killiny, 2023), modular le enhorfina yéetel le hetogenos (Nehela yéetel Killiny, 2023). Killiny, 2019), establecer resistencia adquirida sistémica (SAR), yéetel regular interacciones páak'alo'-patógeno (Nehela yéetel Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). K'a'ana'an u ya'ala'ale' le mecanismos específicos yéetel le ju'uno'ob le PAs ti' le defensa vegetal varían dependiendo de especies vegetales, patógenos, yéetel condiciones ambientales. Le PA asab ya'ab ti' le páak'alo'obo' ku biosintetizar ti' le poliamina tuukulo'obo' L-ornitina (Killiny yéetel Nehela, 2020).
L-ornithine ku báaxal ya'abkach ju'uno'ob ti' tuméen yéetel ma'alo'ob le páak'alo'obo'. Je'ebix, xook ts'o'ok u ye'esik u ti' le arrozo' (Oryza sativa), le ornitina je'el u páajtal u asociada yéetel le reciclaje nitrógeno (Liu et al., 2018), rendimiento arroz, calidad yéetel aroma (Lu et al., 2020), yéetel núukik estrés ja' (Yang et al., 2000). Beyxan, le ka'anatako'ob exógena ti' L-ornitina significativamente mejoró le tolerancia ti' le tikintaj ti' le remolacha azucarera (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) yéetel alivió le estrés ta'ab ti' le cebolla (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu yéetel Çavuşoǧlu, 2021) yéetel le páak'alo' (Cavuşoǧlu (Cavuşoǧlu) yéetel occidental occidental Rocha et al., 2012). Le ju'uno' potencial ti' le L-ornitina ti' le defensa estrés abiótico je'el u páajtal u debido a u participación ti' le acumulación prolina ti' le páak'alo'obo' tratadas. Je'ebix, le genes yaan ba'al u yil yéetel u metabolismo le prolina, bey le ornitina delta aminotransferasa (delta-OAT) yéetel le genes le prolina deshidrogenasa (ProDH1 yéetel ProDH2), ts'o'ok u sido reportados ka'ache' u táakpajalo'ob ti' le defensa Nicotiana benthamiana yéetel Arabidopsis thaliana xu'ullsa'al le cepas Pseudomonas ma' huéspedes (Kumar-S, yéetel Mysoreh 2012). Ba'ale', le ornitina descarboxilasa (ODC) ti' hongos k'a'abéet uti'al u nojochtal le patógeno (Singh et al., 2020). U ts'áabal ODC ti' Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici yo'osal u silenciamiento genético inducido tumen le huésped (HIGS) significativamente mejoró le resistencia le páak'alo'obo' p'aak ti' le marchitamiento Fusarium (Singh et al., 2020). Ba'ale', le ju'uno' potencial ti' le ka'anatako'ob ornitina exógena xu'ullsa'al le tensiones bióticas bey le fitopatógenos ma' u sido ma'alob estudiado. Ba'ax jach k'a'anane', le ba'ax ku beetik le ornitina ti' le resistencia ti' le k'oja'anil yéetel le fenómenos bioquímicos yéetel fisiológicos asociados permanecen tu gran medida ma' explorados.
U na'ata'al u talamil le infección tumen S. sclerotiorum ti' le legumbres jach k'a'anan uti'al u beeta'al estrategias kanik xoknáalo'obo'. Te' xook je'ela', k k'áat k identificar le ju'uno' potencial ti' le diamina L-ornitina bey juntúul factor clave ti' le ma'alo'obkíinsiko'ob le mecanismos defensa yéetel resistencia le páak'alo'obo' legumbres ti' le infección Sclerotinia sclerotiorum. K tukultike', Beyxan ti' kaambalilo'ob ma'alo'obkíinsiko'ob u respuestas defensa le páak'alo'obo' infectadas, L-ornitina xan desempeña jump'éel ju'un k'a'abéet ti' le mantener le noj redox. K proponemos u le táanil potenciales ti' le L-ornitina táan relacionados yéetel le regulación le mecanismos defensa antioxidante enzimático yéetel ma' enzimático yéetel le interferencia yéetel le factores patogenicidad leti' virulencia fúngica yéetel proteínas asociadas. Le ka'ap'éel funcionalidad L-ornitina ku beetik u jump'éel candidato prometedor uti'al jump'éel estrategia sostenible uti'al u mitigar le impacto le moho sak yéetel ma'alo'obkíinsiko'ob u resistencia le cultivos legumbres náats'al ti' le potente patógeno fúngico. Ya'ala'al máaxo'ob máano'ob le xooko' je'el wáantik ti' le ma'alo'ob métodos innovadores, respetuosos yéetel le ka'a jeets' utia'al u controlar le moho sak yéetel mitigar u impacto ti' le producción legumbres.
Te' xook je'ela', jump'éel variedad comercial susceptible u haba común, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), bin utilizado bey xooko'obo' experimental. Neek'o'ob toj óolal ts'a'ab tumen le Departamento u Investigación le Legumbres, Instituto u Investigación u Cultivos u Campo (FCRI), Centro u Investigación Agrícola (ARC), Egipto. Jo'op'éel neek'o'ob bino'ob sembradas ti' macetas plástico (diámetro interior 35 cm, taamil 50 cm) Chuup yéetel lu'um infectado yéetel S. sclerotiorum yáanal condiciones invernadero (25 ± 2 ° C, humedad relativa 75 ± 1%, 8 h sáasil leti' 16 h éek'joch'e'en). Tu 7-10 k'iino'ob ka' u pak'ik (DPS), le plántulas bino'ob adelgazadas utia'al u p'atik chéen ka'ap'éel plántulas yéetel tuméen uniforme yéetel óoxp'éel le' jaatsatako'ob expandidas ti' Amal olla. Tuláakal le paak'alo'ob yaan ti' maceta'obo' ku ts'a'abal ja' juntéene' Amal ka'ap'éel semanas yéetel ku fertilizaron mensualmente ti' le tasa recomendada uti'al le variedad dada.
Utia'al u preparar jump'éel concentración 500 mg leti' L u L-ornithinediamina (xan k'ajóolta'an je'el bix (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), 50 mg bin yáax disuelto ti' 100 mL ja' destilada estéril. Le solución stock bin túun diluida yéetel utilizada ti' experimentos posteriores. Tu kóom t'aan, seis series u concentraciones L-ornitina (12.5, 25, 50, 75, 100, yéetel 125 mg leti' L) bino'ob probadas in vitro. Beyxan, ja' destilada estéril bin utilizada bey jump'éel kaambalil yo'osal negativo (Mock) yéetel fungicida comercial "Rizolex-T" 50 ti chúumuk juuch'bil humectable (toclofos-metil 20 ti chúumuk + thiram 30 ti chúumuk; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governate, Egy) bin utilizado bey jump'éel kaambalil yo'osal positivo. Le fungicida comercial "Rizolex-T" bin u probado in vitro ti' Kanp'éel concentraciones (2, 4, 6, 8 yéetel 10 mg leti' L).
Muestras u tallos u haba náats'al yéetel vainas ku ye'esik síntomas típicos ti' le moho sak (tasa infestación: 10-30%) bino'ob recogidas ti' granjas comerciales. Kex óol tuláakal le máasewáalo'obo' ti' le materiales vegetales infectados bino'ob identificados tumen especie leti' variedad (variedad comercial susceptible Giza 3), láak'o'ob, especialmente le obtenidos ti' le mercados locales, bino'ob u especies desconocidas. Le materiales infectados recogidos bino'ob yáax desinfectados ti' le superficie yéetel solución hipoclorito sodio 0,5 ti chúumuk ichil 3 minutos, ts'o'okole' enjuagado ya'abkach Óoxten yéetel ja' destilada estéril yéetel p'o'ik tikin yéetel ju'un filtro estéril utia'al u luk'ul Teeche' le exceso ja'. Le órganos infectados bino'ob túun cortados ti' mejen trozos ti' le wa'ak'al chúumuk (ichil tejidos saludables yéetel infectados), cultivados ti' chúumuk agar dextrosa patata (PDA) yéetel incubados ti' 25 ± 2 ° C yéetel juntúul ciclo 12 h sáasil leti' 12 h éek'joch'e'en ichil 5 k'iino'ob utia'al u estimular le formación esclerocia. Le método xnuk micelial xan u utilizado utia'al u purificar aislados hongos u cultivos mixtos wa contaminados. Le aislado hongos purificado yáax bin identificado basado ti' u características morfológicas miatsil ka tu láak' confirmado u S. sclerotiorum basado ti' yáantajo'ob microscópicas. Tu ts'ooke', tuláakal le aislados purificados bino'ob u probados utia'al u patogenicidad ti' le cultivar haba común susceptible Giza 3 utia'al u satisfacer le postulados Koch.
Beyxan, le aislado S. sclerotiorum asab invasivo (aislado #3) bin u confirmado asab basado ti' le secuenciación espaciador transcrito interno (ITS) bey descrito tumen White et el., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Brevemente, le aislados bino'ob cultivados ti' caldo dextrosa patata (PDB) yéetel incubados ti' 25 ± 2 ° C ichil 5-7 k'iino'ob. Le micelio hongos bin túun recogido, filtrado tumen cheesecloth, p'o'ik ka'ap'éel Óoxten yéetel ja' estéril, ka secado yéetel ju'un filtro estéril. Le ADN genómico bin u aislado utilizando le Quick-DNATM Fungal leti' Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Le región rDNA ITS bin túun amplificada utilizando le par específico u cebador ITS1 leti' ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; Buka'aj esperado: 540 bp) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). Le yik'áalil PCR purificados bino'ob sometidos utia'al u secuenciación (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Le secuencias rDNA ITS bino'ob secuenciadas bidireccionalmente utilizando le método secuenciación Sanger. Le secuencias consultas ensambladas bino'ob túun comparadas yéetel le datos asab recientes ti' GenBank yéetel le Centro Nacional u A'alajil t'aan ti' Biotecnología (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) utilizando software BLASTn. Le secuencia consulta bin u comparada yéetel 20 uláak' cepas leti' aislados S. sclerotiorum recuperados ti' le datos asab recientes ti' NCBI GenBank (Tabla suplementaria S1) utilizando ClustalW ti' le paquete análisis genética evolutiva molecular (MEGA-11; versión 11) (Kumar et al., 2024). Le análisis evolutivo u beeta'al utilizando le método máximo probabilidad yéetel le bix u sustitución nucleótidos reversibles tumen k'iin general (Nei yéetel Kumar, 2000). ku ye'esik le che'o' yaan u asab ka'anal log-likelihood. Le che'o' inicial uti'al u xookilo' heurística ku yéeyik tumen u yéeyik le che'o' yéetel le asab log-likelihood ichil le che'o' neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) yéetel le máxima parsimonia (MP) che'o'. Le che'o' NJ bin construida utilizando jump'éel matriz distancia par calculada utilizando le bix general k'iin-reversible (Nei yéetel Kumar, 2000).
Le actividad antibacteriana ti' L-ornitina yéetel le bactericida "Rizolex-T" bin determinada in vitro tumen le método difusión agar. Bix: Ch'a' le cantidad apropiada ti' le solución stock u L-ornitina (500 mg leti' L) yéetel xa'ak'tik ma'alob yéetel 10 ml ti' le chúumuk nutriente PDA utia'al u preparar soluciones yéetel concentraciones finales u 12.5, 25, 50, 75, 100 yéetel 125 mg leti' L, respectivamente. Kanp'éel concentraciones ti' le fungicida "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 yéetel 10 mg leti' L) yéetel ja' destilada estéril u utilizaron bey juntúul kaambalil yo'osal. Le ken ts'o'ok u solidificar le chúumuk, jump'éel tapón micelial recién preparado u miatsil Sclerotinia sclerotiorum, 4 mm u metros, bin transferido u chúumukil le plato Petri yéetel cultivado ti' 25 ± 2 ° C tak ka le micelio cubrió tuláakal le plato Petri kaambalil yo'osal, ka' le ba'ala' bin registrado tuméen hongos. Calcular le porcentaje inhibición tuméen radial u S. sclerotiorum utilizando ecuación 1:
Le experimento bin u repetido ka'atéen, yéetel seis réplicas biológicas utia'al Amal múuch' kaambalil yo'osal leti' experimental yéetel Kanp'éel macetas (ka'ap'éel paak'alo'ob tumen pote) utia'al Amal réplica biológica. Amal réplica biológica bin u analizada ka'ap'éel Óoxten (ka'ap'éel réplicas técnicas) utia'al u asegurar le exactitud, fiabilidad yéetel reproducibilidad ti' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob experimentales. Beyxan, u análisis u regresión probit u utilizado utia'al u calcular le concentración inhibitoria chúumuk máxima (IC50) yéetel IC99 (Prentice, 1976).
Utia'al u p'is óoltik u páajtalil L-ornitina yáanal condiciones invernadero, u realizaron ka'ap'éel experimentos consecutivos ti' olla. Tu kóom t'aan, le macetas bino'ob Chuuptak yéetel lu'um arcilla-arena esterilizada (3:1) yéetel inoculadas yéetel juntúul miatsil recién preparada u S. sclerotiorum. Yáax, le aislado asab invasivo ti' S. sclerotiorum (aislado #3) bin cultivado tumen ch'ak jump'éel esclerotio ti' chúumuk, colocando u yich tak kaambal ti' jump'éel PDA yéetel incubando ti' 25 ° C ti' éek'joch'e'enil constante (24 h) ichil 4 k'iino'ob utia'al u estimular tuméen micelial. Kanp'éel tapones agar 5 mm metros bino'ob túun tomados ti' le borde líder yéetel inoculados yéetel 100 g jump'éel mezcla estéril u trigo yéetel salvado arroz (1:1, v leti' v) yéetel tuláakal le matraces bino'ob incubados ti' 25 ± 2 ° C yáanal jump'éel ciclo 12 h sáasil leti' 12 h éek'joch'e'en ichil 5 k'iino'ob utia'al u estimular le formación sclerotia. Le ba'ax yaan ti' tuláakal le matraces ku xa'ak'pajal ma'alob uti'al u yantal homogeneidad bey ma' u ts'áabal lu'um. Tu láak', 100 g ti' le mezcla salvado colonizador ku ts'áabal ti' Amal olla utia'al u asegurar jump'éel concentración constante ti' patógenos. Le macetas inoculadas bino'ob regadas utia'al u activar tuméen hongos yéetel colocadas ti' condiciones invernadero ichil 7 k'iino'ob.
Kanp'éel neek'o'ob ti' le variedad Giza 3 bino'ob túun sembradas ti' Amal olla. Utia'al le macetas tratadas yéetel L-ornitina yéetel le fungicida Rizolex-T, le neek'o'obo' esterilizadas bino'ob yáax empapadas ichil ka'ap'éel horas ti' jump'éel solución acuosa ti' le ka'ap'éel compuestos yéetel juntúul concentración final IC99 u yan 250 mg leti' L yéetel 50 mg leti' L, respectivamente, ka tu láak' secado ti' iik' ichil jump'éel p'isib bey ma' sembrar. Ba'axten otra parte, le neek'o'obo' bino'ob empapadas ti' ja' destilada estéril bey juntúul kaambalil yo'osal negativo. Ka' 10 k'iino'ob, bey ma' u yáax riego, le plántulas bino'ob adelgazadas, p'áatal chéen ka'ap'éel plántulas ordenadas ti' Amal olla. Beyxan, uti'al u yantal infección yéetel S. sclerotiorum, u tallos le páak'alo' haba ti' le bak'paach p'isibij ma'alo'ob (10 k'iino'ob) bino'ob ch'ak ti' ka'ap'éel kúuchilo'ob jejeláas utilizando jump'éel bisturí esterilizado yéetel yan 0,5 g ti' le mezcla salvado colonizador bin colocado ti' Amal herida, seguido tumen ka'anal humedad utia'al u estimular le infección yéetel tuláakal le ma'alo'ob infeccionado ti' le páak'alo'. Le páak'alo'obo' kanik bino'ob similarmente heridas yéetel jump'éel cantidad igual (0.5 g) u mezcla salvado estéril, ma' colonizado bin colocada ti' le herida yéetel mantenida yáanal ka'anal humedad utia'al u simular le entorno utia'al u ma'alo'ob le k'oja'anil yéetel asegurar consistencia ichil le múuch' Ts'a'akal.
Bix u ts'aak: Le paak'alo'ob habas bino'ob regadas yéetel 500 ml jump'éel solución acuosa u L-ornitina (250 mg leti' l) wa le fungicida Rizolex-T (50 mg leti' l) tumen riego le lu'umo', ts'o'okole' le Ts'a'akal bin u repetido óoxp'éel Óoxten ti' jump'éel intervalo 10 k'iino'ob. Le controles tratados yéetel placebo bino'ob irrigados yéetel 500 ml ja' destilada estéril. Tuláakal le tratamientos bino'ob u realizados yáanal condiciones invernadero (25 ± 2°C, 75 ± 1% humedad relativa, yéetel juntúul fotoperíodo 8 h sáasil leti' 16 h éek'joch'e'en). Tuláakal le macetas bino'ob regadas quincenales yéetel tratadas mensualmente yéetel juntúul fertilizante NPK equilibrado (20-20-20, yéetel 3.6 ti chúumuk azufre yéetel microelementos TE; Zain Seeds, Egipto) ti' jump'éel concentración 3-4 g leti' l tumen rociadura foliar bin le recomendaciones utia'al u variedad específica yéetel le t'aano'ob le fabricación. Wa ma' u ya'ala'al uláak' bix ken, le' maduras jaatsatako'ob expandidas (2a yéetel 3a le' tak ka'anal) bino'ob recogidas ti' Amal réplica biológica ti' 72 h post-tratamiento (hpt), homogeneizadas, agrupadas yéetel almacenadas ti' -80 ° C utia'al u asab análisis incluyendo, Ba'ale' ma' u limita ti', in situ localización histoquímica u estrés oxidativo, indicadores peroxidantes, peroxidantes yéetel enzidas antioxidantes ma' enzimáticos yéetel expresión genética.
U muuk' le infección tumen moho sak bin evaluada semanal 21 k'iino'ob ka' le inoculación (dpi) utilizando jump'éel escala 1-9 (Tabla suplementaria S2) basada ti' le escala Petzoldt yéetel Dickson (1996) modificada tumen Teran et el. (2006). Tu kóom t'aan, u tallos yéetel u k'ab le páak'alo'obo' habas bino'ob examinados ku káajal le ch'aaj inoculación utia'al u t'u'uchpachtik le progresión le lesiones a lo largo de internodos yéetel nodos. Le náachil le lesión tak le ch'aaj inoculación tak le ch'aaj asab náach a lo largo de le tallo wa k'ab bin túun P'iis ka jump'éel puntuación 1-9 bin asignada basada ti' le tu'ux ku yaantal le lesión, tu'ux (1) indicaba mix infección visible naats' le ch'aaj inoculación yéetel (2-9) indicaba jump'éel aumento gradual ti' le Buka'aj le lesión yéetel le progresión a lo largo de nodos internodos (Tabla S2). U muuk'il le infección tumen moho sak bin túun sutk'esiko'ob ti' porcentaje utilizando le fórmula 2:
Beyxan, le yo'osal yáanal le curva progresión le k'oja'anil (AUDPC) bin calculada utilizando le fórmula (Shaner yéetel Finney, 1977), ku bin adaptada ts'oonak utia'al u putrefacción sak u haba común (Chauhan et al., 2020) utilizando ecuación 3:
Tu'ux Yi = gravedad le k'oja'anil ti' le k'iin ti', Yi + 1 = gravedad le k'oja'anil ti' le uláak' k'iin ti + 1, ti = k'iin u yáax medición (ti' k'iino'ob), ti + 1 = k'iin u láak' medición (ti' k'iino'ob), n = meyaj ku total u ti'its k'iin wa ti'its observación. Le parámetros tuméen le páak'alo' haba incluyendo ka'anilo' le páak'alo' (cm), meyaj ku k'ab tumen páak'alo', yéetel meyaj ku le' tumen páak'alo' bino'ob registrados semanales ichil 21 k'iino'ob ti' tuláakal le réplicas biológicas.
Ti' Amal replicado biológico, muestras le' (segunda yéetel tercera le' jaatsatako'ob desarrolladas tak ka'anal) bino'ob recogidas ti' le k'iin 45 ka' u Ts'a'akal (15 k'iino'ob ka' u ts'ook Ts'a'akal). Amal replicado biológico consistía ti' jo'op'éel macetas (ka'ap'éel paak'alo'ob tumen maceta). Óoli' 500 mg ti' le wa'ak'al triturado bin utilizado utia'al u extracción pigmentos fotosintéticos (clorofila a, clorofila b yéetel carotenoides) utilizando 80 ti chúumuk acetona ti' 4 ° C ti' éek'joch'e'en. Ka' 24 h, le muestras bino'ob centrifugadas yéetel le sobrenadante bin recogida utia'al u determinación le clorofila jump'éel, clorofila b yéetel contenidos carotenoides colorimétricamente utilizando jump'éel espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) bin le método u (Lichtenthaler, 1987) medición le absorción ti' jejeláas longitudes ondas (A470, A646 yéetel A663 nm). Tu ts'ooke', u contenido le pigmentos fotosintéticos bin u calculado utilizando le je'ela' fórmulas 4-6 descritas tumen Lichtenthaler (1987).
Tu 72 h post-tratamiento (hpt), le' (segunda yéetel tercera le' jaatsatako'ob desarrolladas tak ka'anal) bino'ob recogidas ti' Amal réplica biológica utia'al u localización histoquímica in situ u peróxido hidrógeno (H2O2) yéetel anión superóxido (O2•−). Amal replicado biológico consistía ti' jo'op'éel macetas (ka'ap'éel paak'alo'ob tumen maceta). Amal réplica biológica bin u analizada ti' duplicado (ka'ap'éel réplicas técnicas) utia'al u asegurar le exactitud, fiabilidad yéetel reproducibilidad le método. H2O2 yéetel O2•− bino'ob determinados utilizando 0.1% 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) wa nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), respectivamente, siguiendo le métodos descritos tumen Romero-Puertas et al. (2004) yéetel Adam et al. (1989) yéetel mejen k'eexo'ob. Utia'al u localización histoquímica u H2O2 in situ, le folletos bino'ob infiltrados ti' le vacío yéetel 0.1 ti chúumuk DAB ti' 10 mM tampón Tris (pH 7.8) ka tu láak' incubaron u temperatura ambiente ti' le sáasilo' ichil 60 min. Le folletos bino'ob blanqueados ti' 0.15% (v/v) TCA ti' 4:1 (v/v) etanol:cloroformo (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egipto) ka tu láak' expuestos ti' le sáasilo' tak ka éek'joch'e'en. Bey xan, le válvulas bino'ob infiltradas ti' le vacío yéetel 10 mM tampón fosfato potasio (pH 7.8) ku taasik 0.1 w leti' v % HBT utia'al u localización histoquímica u O2•− in situ. Le folletos bino'ob incubados ti' le sáasilo' u temperatura ambiente ichil 20 min, ts'o'okole' blanqueados bey ka'anal, ka tu láak' iluminados tak ka aparecieron ti'its azul éek'joch'e'en leti' violeta. U muuk'il le boonil marrón (bey indicador H2O2) wa azul-violeta (bey indicador O2•−) ku jóok'olo' bin evaluada utilizando le versión Fiji ti' le paquete procesamiento wíimbala' ImageJ (http://fiji.sc; tsáabaltio'ob áantaj 7 u marzo u 2024).
Le malondialdehído (MDA; bey jump'éel marcador u peroxidación le lípidos) bin determinado bin le método Du yéetel Bramlage (1992) yéetel ligeras modificaciones. Le' Amal replicado biológico (segunda yéetel tercera le' jaatsatako'ob desarrolladas tak ka'anal) bino'ob recogidas 72 h post-tratamiento (hpt). Amal replicado biológico incluyó jo'op'éel macetas (ka'ap'éel paak'alo'ob tumen maceta). Amal réplica biológica bin u analizada ti' duplicado (ka'ap'éel réplicas técnicas) utia'al u asegurar le exactitud, fiabilidad yéetel reproducibilidad le método. Tu kóom t'aan, 0.5 g u wa'ak'al le' lu'um bin utilizado utia'al u extracción MDA yéetel 20 ti chúumuk ácido tricloroacético (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) ku taasik 0.01 ti chúumuk hidroxitolueno butilado (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Le contenido MDA ti' le sobrenadante bin túun determinado colorimétricamente tumen P'iis le absorción ti' 532 yéetel 600 nm utilizando jump'éel espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) ka tu láak' expresado bey nmol g−1 FW.
Utia'al u p'is óoltik le antioxidantes ma' enzimáticos yéetel enzimáticos, le' (segunda yéetel tercera le' jaatsatako'ob desarrolladas tak ka'anal) bino'ob recogidas ti' Amal réplica biológica ti' 72 h post-tratamiento (hpt). Amal replicado biológico consistía ti' jo'op'éel macetas (ka'ap'éel paak'alo'ob tumen maceta). Amal muestra biológica bin u analizada ti' duplicado (ka'ap'éel muestras técnicas). Ka'ap'éel le'o'ob bino'ob molidas yéetel nitrógeno líquido yéetel utilizadas Jun utia'al u determinación le antioxidantes enzimáticos yéetel ma' enzimáticos, aminoácidos totales, contenido prolina, expresión genética, yéetel cuantificación oxalato.
Le fenólicos solubles totales bino'ob determinados utilizando reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) yéetel leves modificaciones ti' le método descrito tumen Kahkonen et el. (1999). Tu kóom t'aan, yan 0.1 g u wa'ak'al le' homogeneizado bin extraído yéetel 20 ml 80 ti chúumuk metanol ti' le éek'joch'e'en ichil 24 h yéetel le sobrenadante bin recogido ka' u centrifugación. 0.1 ml ti' le extracto muestra ku xa'ak'pajal yéetel 0.5 ml reactivo Folin-Ciocalteu (10 ti chúumuk), sacudido ichil 30 s yéetel p'áatal ti' éek'joch'e'en ichil 5 min. Tu láak' 0.5 ml u solución carbonato sodio 20 ti chúumuk (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egipto) ku ts'áabal ti' Amal tubo, mezclado ma'alob yéetel incubado ti' temperatura ambiente ti' éek'joch'e'en ichil 1 h. Ka' ts'o'ok u incubación, u absorción le mezcla reacción bin u P'iis ti' 765 nm utilizando jump'éel espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón). Le concentración fenoles solubles totales ti' le extractos muestra bin determinada utilizando jump'éel curva calibración ácido gálico (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) yéetel expresado bey miligramos u equivalente ácido gálico tumen gramo peso fresco (mg GAE g-1 peso fresco).
Le contenido total u flavonoides solubles bin determinado bin le método Djeridane et el. (2006) yéetel jump'íit k'eexo'ob. Tu kóom t'aan, 0.3 ml ti' le extracto metanol anterior bin u xa'ak'pajal yéetel 0.3 ml ti' solución cloruro aluminio 5 ti chúumuk (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), vigorosamente agitado ka tu láak' incubado ti' temperatura ambiente ichil 5 min, seguido tumen le adición 0.3 ml ti' solución potasio 0 ti chúumuk asio (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egipto), ma'alob xa'ak'pajal yéetel incubado ti' temperatura ambiente ichil 30 min ti' le éek'joch'e'enil. Ka' ts'o'ok u incubación, u absorción le mezcla reacción bin u P'iis ti' 430 nm utilizando jump'éel espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón). Le concentración flavonoides solubles totales ti' extractos muestras bin determinada utilizando jump'éel curva calibración rutina (TCI America, Portland, OR, USA) ka tu láak' expresada bey miligramos equivalente rutina tumen gramo peso fresco (mg RE g-1 peso fresco).
Le contenido total u aminoácidos libres u le' le haba bin determinado utilizando jump'éel reactivo ninhidrina modificado (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) basado ti' le método propuesto tumen Yokoyama yéetel Hiramatsu (2003) yéetel modificado tumen Sun et al. (2006). Tu kóom t'aan, 0.1 g u wa'ak'al lu'um bin extraído yéetel tampón pH 5.4, ka 200 μL ti' le sobrenadante bin reaccionado yéetel 200 μL ninhidrina (2 ti chúumuk) yéetel 200 μL piridina (10 ti chúumuk; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), incubado ti' ja' ebulliente utia'al u P'iis 30 min ti' 580 nm utilizando jump'éel espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón). Ba'ale', le prolina bin determinada tumen le método Bates (Bates et al., 1973). Le prolina ku jóok'sa'al yéetel 3% ácido sulfosalicílico (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) yéetel ka' u centrifugación, 0,5 ml ti' le sobrenadante ku xa'ak'pajal yéetel 1 ml ácido acético glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) yéetel reactivo ninhidrina, incubado ti' 90 ° C, yéetel cooled mined p'iss bey ti' 520 nm utilizando le k'iino' je'el xano' espectrofotómetro bey ka'anal. Le aminoácidos libres totales yéetel le prolina ti' le extractos u le' bino'ob determinados utilizando curvas u calibración glicina yéetel prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), respectivamente, ka expresados ​​bey mg leti' g peso fresco.
Utia'al u yojéelta'al u meyaj enzimática le enzimas antioxidantes, yan 500 mg u wa'ak'al homogeneizado bin extraído yéetel 3 ml u tampón Tris 50 mM (pH 7.8) ku taasik 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) yéetel 7.5% polipirolidona (PP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugado ti' 10.000 × g ichil 20 min yáanal refrigeración (4 ° C), yéetel le sobrenadante (extracto enzima crudo) bin recogido (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Catalasa (CAT) bin túun reaccionada yéetel 2 ml u 0.1 M tampón fosfato sodio (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) yéetel 100 μl u solución 269 mM H2O2 utia'al u determinar u actividad enzimática bin le método Aebi (1984) yéetel modificaciones slight-Nagar et al. 2023; Osman et al., 2023). U meyaj le enzimática ti' le peroxidasa dependiente ti' Guaiacol (POX) bin determinada utilizando le método u Harrach et el. (2009). (2008). Portland, OR, USA) yéetel 100 μl u 12 mM H2O2. Le método bin jump'íit modificado u (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Le ensayo ku beeta'al ka' u reacción yéetel 3 ml u solución catecol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) recién preparado ti' 0.1 M tampón fosfato (pH 6.0). U meyaj CAT bin u p'iis tumen u yila'al u descomposición H2O2 ti' 240 nm (A240), u meyaj POX bin u p'iis tumen u yila'al u ya'abtal le absorción ti' 436 nm (A436), yéetel u meyaj PPO bin u p'iis tumen u k'a'abetkuunsa'al le fluctuaciones ti' absorción ti' 495 nm (A495) Amal 30 s ichil 30 s ichil 30 s utilizando jump'éel UV-forómetro (Shimadzu, Japón).
RT-PCR tu k'iinil xíimbal tumen bin utilizado utia'al u detectar le niveles transcripción óoxp'éel genes relacionados yéetel antioxidantes, incluyendo catalasa peroxisomal (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superóxido dismutasa (PvSOD; GenBank Accession No. XM_06863955), yéetel glutasa reductase (GenBank; Accesión No. KY195009.1), ti' le' haba (le segunda yéetel tercera le' jaatsatako'ob desarrolladas tak ka'anal) 72 h ka' le ts'ook Ts'a'akal. Tu kóom t'aan, le RNA bin aislado utilizando Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) bin le protocolo le fabricante. Tu láak', cDNA bin sintetizado utilizando TOP scriptTM cDNA Synthesis Kit bin le t'aano'ob le fabricante. Le secuencias cebador ti' le óoxp'éel genes anteriores ku enumeran ti' le tabla suplementaria S3. PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) bin utilizado bey le gen limpieza yéetel le expresión genética relativa bin calculada utilizando le método 2-ΔΔCT (Livak yéetel Schmittgen, 2001). U estabilidad le actina yáanal estrés biótico (interacción incompatible ichil legumbres náats'al yéetel le hongo antracnosis Colletotrichum lindemuthianum) yéetel estrés abiótico (sequía, salinidad, baja temperatura) bin demostrado (Borges et al., 2012).
Tu káajbale' k meentik jump'éel análisis in silico ti' tuláakal le genoma ti' proteínas oxaloacetato acetilhidrolasa (OAH) ti' S. sclerotiorum utilizando le nu'ukula' proteína-proteína BLAST (BLASTp 2.15.0 +) (Altschul et al., 1997, 2005). Tu kóom t'aan, utilizamos OAH u Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxido: 1191702; meyaj ku accesión GenBank XP_040799428.1; 342 aminoácidos) yéetel Penicillium lagena (PlOAH; taxido: 94218; meyaj ku accesión Gen. Bank XP_056833920.1; 316 aminoácidos) bey secuencias consulta utia'al u mapear le proteína homóloga ti' S. sclerotiorum (taxido: 5180). BLASTp bin u meentik xu'ullsa'al le datos genoma S. sclerotiorum asab ts'oonak disponibles ti' GenBank ti' le ts'ono'oto' web u Centro Nacional u A'alajil t'aan ti' Biotecnología (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Beyxan, le gen OAH predicho ti' S. sclerotiorum (SsOAH) yéetel le análisis evolutivo yéetel le che'o' filogenético ti' AfOAH ti' A. fijiensis CBS 313.89 yéetel PlOAH ti' P. lagena bino'ob inferidos utilizando le método máximo probabilidad ti' MEGA11 (Tamura et al., 2021) yéetel le modelo matriones JTT et al., 1992). Le che'o' filogenético bin combinado yéetel le análisis alineación múltiple ti' secuencias proteínas tuláakal le genes OAH predecidos (SsOAH) u S. sclerotiorum yéetel le secuencia consulta utilizando le nu'ukula' alineación basada ti' restricciones (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt Agarwala, 2007). Beyxan, le secuencias aminoácidos asab ma'alo'ob u coincidencia u SsOAH u S. sclerotiorum bino'ob alineadas yéetel le secuencias consulta (AfOAH yéetel PlOAH) (Larkin et al., 2007) utilizando ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), yéetel le regiones conservadas bino'ob alineadas in visualizadas utilizando le ESP nu'ukula' (versión 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Beyxan, le dominios representativos funcionales predecidos yéetel le kúuchilo'ob conservados ti' S. sclerotiorum SsOAH bino'ob interactivamente clasificados ti' jejeláas familias utilizando le nu'ukula' InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Tu ts'ooke', u modelado u ba'ax tridimensional (3D) ti' le predicho S. sclerotiorum SsOAH u tu beetaj utilizando le Protein Homology leti' Analogy Recognition Engine (Phyre2 server versión 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.c.gid=index) (Kelley et al., K. 2015) yéetel validado utilizando le servidor SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Le ba'ax tridimensionales predecidas (formato PDB) bino'ob interactivamente visualizadas utilizando le paquete UCSF-Chimera (versión 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Utia'al u yojéelta'al u nivel transcripcional ti' oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) meyajnaj ti' le micelios ti' Sclerotinia sclerotiorum. Tu kóom t'aan, S. sclerotiorum bin inoculado ti' jump'éel matraz ku taasik PDB yéetel colocado ti' jump'éel incubadora agitación (modelo: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ti' 25 ± 2 ° C ichil 24 h ti' 150 rpm yéetel ti' éek'joch'e'enil constante (24 h) utia'al u estimular tuméen micelial. Ka' lelo', le células bino'ob tratadas yéetel L-ornitina yéetel le fungicida Rizolex-T ti' concentraciones finales IC50 (yan 40 yéetel 3.2 mg leti' L, respectivamente) ka tu láak' cultivadas ichil uláak' 24 h yáanal le bak'paach condiciones. Ka' ts'o'ok u incubación, le cultivos bino'ob centrifugados ti' 2500 rpm ichil 5 min yéetel le sobrenadante (micelio fúngico) bin recogido utia'al u análisis expresión genética. Bey xan, le micelio fúngico bin u recogido ti' 0, 24, 48, 72, 96, yéetel 120 h post-infección ti' le páak'alo'obo' infectadas ku habían formado moho sak yéetel micelio algodón ti' le superficie le tejidos infectados. ARN bin extraído ti' le micelio fúngico ka tu láak' cDNA bin sintetizado bey descrito ka'anal. Le secuencias cebador utia'al u SsOAH ku enumeran ti' le tabla suplementaria S3. SsActin (GenBank accession number: XM_001589919.1) bin utilizado bey le gen limpieza, ka expresión genética relativa bin calculada utilizando le método 2-ΔΔCT (Livak yéetel Schmittgen, 2001).
Le ácido oxálico bin determinado ti' caldo dextrosa patata (PDB) yéetel muestras vegetales ku ya'alik le patógeno fúngico Sclerotinia sclerotiorum bin le método Xu yéetel Zhang (2000) yéetel modificaciones leves. Tu kóom t'aan, le aislados S. sclerotiorum bino'ob inoculados ti' matraces ku ya'alik PDB ka tu láak' cultivados ti' jump'éel incubadora agitación (modelo I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ti' 150 rpm ti' 25 ± 2 ° C ichil 3-5 k'iino'ob ti' éek'joch'e'enil constante (24 h) utia'al u estimular tuméen micelial. Ka' ts'o'ok u incubación, le cultivo fúngico bin yáax filtrado tumen ju'un filtro Whatman #1 ka tu láak' centrifugado ti' 2500 rpm ichil 5 min utia'al u luk'ul Teeche' le micelio residual. Le sobrenadante bin u recogido yéetel almacenado ti' 4 ° c utia'al u asab determinación cuantitativa ti' le oxalato. Utia'al u preparación le muestras vegetales, yan 0.1 g u fragmentos u wa'ak'al vegetales bino'ob extraídos óoxp'éel Óoxten yéetel ja' destilada (2 ml Amal ka'atéen). Le muestras bino'ob túun centrifugadas ti' 2500 rpm ichil 5 min, le sobrenadante bin tikin filtrado tumen ju'un filtro Whatman No. 1 yéetel recogidos utia'al u asab análisis.
Utia'al u análisis cuantitativo ti' le ácido oxálico, le mezcla reacción bin u preparada ti' jump'éel tubo tapón u vidrio ti' le je'ela' orden: 0,2 ml u muestra (wa filtrado miatsil PDB wa solución estándar u ácido oxálico), 0,11 ml u azul bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, USA, Ml 1901), Ml ácido sulfúrico (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) yéetel 0.176 ml u 100 mM dicromato potasio (K2Cr2O7; yik'áalil TCI, Portland, OR, USA), ka tu láak' le solución bin diluida ti' 48 mM yéetel ja' yéetel vigorosamente mezclado tu séeba'anil ts'a'abal ti' jump'éel wichkíil ja' 60 °C. Ka' 10 min, le reacción bin u parada tumen le adición 0,5 ml u solución hidróxido sodio (NaOH; 0,75 M). Le absorción (A600) ti' le mezcla reacción bin u P'iis ti' 600 nm utilizando jump'éel espectrofotómetro UV-160 (Shimadzu Corporation, Japón). PDB yéetel ja' destilada u utilizaron bey kaambalilo'ob utia'al u cuantificación le filtrados cultivos yéetel muestras páak'alo'obo', respectivamente. Le concentraciones ácido oxálico ti' le filtrados cultivos, expresados ​​bey microgramos u ácido oxálico tumen mililitro u chúumuk PDB (μg.mL−1), yéetel ti' le extractos le', expresados ​​bey microgramos u ácido oxálico tumen gramo u peso fresco (μg.g−1 FW), bino'ob determinados utilizando jump'éel curva ácido oxálico calibra (The Firs Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
ichil le xooko', tuláakal le experimentos bino'ob diseñados ti' jump'éel diseño jaatsatako'ob aleatorio (CRD) yéetel seis réplicas biológicas tumen Ts'a'akal yéetel Kanp'éel macetas tumen réplica biológica (ka'ap'éel paak'alo'ob tumen pote) a menos u ya'alik uláak' bix ken. Le réplicas biológicas bino'ob analizadas ti' ka'ap'éel (ka'ap'éel réplicas técnicas). Le réplicas técnicas u utilizaron utia'al u wilik le reproducibilidad ti' le k'iino' je'el xano' experimento Ba'ale' ma' u utilizaron ti' le análisis estadístico utia'al Jech réplicas espurias. Le datos bino'ob analizados estadísticamente utilizando análisis u varianza (ANOVA) seguido tumen Tukey-Kramer honestamente significativa diferencia (HSD) prueba (p ≤ 0.05). Utia'al u experimentos in vitro, IC50 yéetel IC99 valores bino'ob calculados utilizando le bix probit yéetel 95% intervalos confianza bino'ob calculados.
Jun múuch' kantúul aislados bino'ob recogidos ti' jejeláas sikte soja ti' le Gobernación El Ghabiya, Egipto. Ti' chúumuk PDA, tuláakal le aislados producidos micelio sak cremoso ku jáan sutnaj ti' sak piits' (yoochel 1A) ka tu láak' beige wa marrón ti' le p'isibij esclerotio. Le esclerotia'obo' suuk u densos, negros, esféricos wa irregulares ti' beyo', 5.2 u 7.7 mm u chowakil yéetel 3.4 u 5.3 mm u metros (yoochel 1B). Kex kantúul aislados desarrollaron jump'éel patrón marginal u esclerocia ti' le borde le chúumuk cultivo ka' 10-12 k'iino'ob u incubación ti' 25 ± 2 ° C (Fig. 1A), le meyaj ku esclerocia tumen placa bin significativamente jela'an ichil leti'ob (P < 0.001), yéetel le aislado 3 yaantal le asab meyaj ku u sclerocia (33 ± 33 esclerocia tumen placa; Fig. 1C). Bey xan, le aislado #3 tu beetaj asab ácido oxálico ti' PDB u uláak' aislados (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fig. 1D). Le aislado #3 tu ye'esaj características morfológicas yéetel microscópicas típicas ti' le hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum. Je'ebix, ti' PDA, colonias u aislado #3 crecieron jáan, bino'ob sak cremoso (Figura 1A), beige inverso wa salmón sáasil k'an-marrón, ka requirió 6-7 k'iino'ob ti' 25 ± 2 ° C utia'al u pixik completamente u superficie jump'éel placa 9 cm metros. Yóok'ol le características morfológicas yéetel microscópicas anteriores, le aislado #3 bin identificado bey Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Características yéetel patogenicidad u S. sclerotiorum aislados u cultivos legumbres náats'al. (A) tuméen micelial u kantúul aislados S. sclerotiorum ti' chúumuk PDA, (B) esclerocia u kantúul aislados S. sclerotiorum, (C) meyaj ku u esclerocia (tuméen placa), (D) secreción ácido oxálico ti' chúumuk PDB (μg.mL−1), yéetel (E) gravedad le k'oja'anil (%) u kantúul aislados S. Sclerotiorum susceptibles ti' le patas comerciales cultivar Giza 3 yáanal condiciones u invernadero. Le ba'alo'ob ku chíikbesiko'ob u chúumuk ± SD ti' Kanp'éel réplicas biológicas (n = 5). Jejeláas letras ku ye'esik jela'anil estadísticamente significativa ichil le tratamientos (p < 0.05). (F-H) Le síntomas típicos ti' le moho sak chíikpaj ti' le tallos yéetel sílices yóok'ol lu'um, respectivamente, 10 k'iino'ob ka' inoculación yéetel aislado #3 (dpi). (I) Análisis evolutivo ti' le región espaciador transcrito interno (ITS) ti' S. sclerotiorum aislado #3 u tu beetaj utilizando le método máximo probabilidad yéetel comparado yéetel 20 aislados leti' cepas u k'a'ana'an obtenidos ti' le k'oja'ano'obo' u datos u Centro Nacional u A'alajil t'aan ti' Biotecnología (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.h.v/). Le meyaj ku yaan yóok'ol le líneas agrupación indican le cobertura región (%), yéetel le números yáanal le líneas agrupación indican le longitud k'ab.
Beyxan, uti'al u jaajkúunta'al u patogenicidad, kantúul aislados S. sclerotiorum obtenidos u utilizaron utia'al u inocular le cultivar haba comercial susceptible Giza 3 yáanal condiciones invernadero, ba'ax le consistente yéetel le postulados Koch (Fig. 1E). Kex tuláakal le aislados fúngicos obtenidos bino'ob patógenos yéetel je'el u páajtal u infectar le haba ya'ax (cv. Giza 3), causando síntomas típicos u moho sak ti' tuláakal le pak'chaje' por encima de le lu'umo' (Fig. 1F), especialmente ti' le tallos (Fig. 1G) yéetel vainas (Fig. 1H) ti' 10 k'iino'ob post inoculación (Fig. 1H), le aislado asab agresivo (pig. 3), le aislado bin asab agresivo ka'ap'éel experimentos independientes. Le aislado 3 yaan ka'ach u asab gravedad le k'oja'anil (%) ti' le páak'alo'obo' habas (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, yéetel 76.7 ± 3.1 ti' 7, 14, yéetel 21 k'iino'ob post-infección, respectivamente; Figura 1F).
U k'ajóolta'al le asab invasivo S. sclerotiorum aislado #3 bin u confirmado asab basado ti' le secuenciación espaciador transcrito interno (ITS) (Fig. 1I). Análisis filogenético ichil le aislado #3 yéetel 20 aislados leti' cepas u k'a'ana'an tu ye'esaj ka'anal similitud (>99%) ichil leti'ob. K'a'ana'an u ya'ala'ale' le S. sclerotiorum aislado #3 (533 bp) yaan jump'éel ka'anal similitud yéetel le aislado S. sclerotiorum estadounidense LPM36 aislado ti' neek'o'obo' guisantes secos (GenBank meyaj ku accesión MK896659.1; 540 bp) yéetel le aislado S. sclerotiorum chino YK1Y (GenBank meyaj ku accesión OR206374.1; 548 bp), ku beetik u putrefacción le tallo violeta (Matthiola incana), tuláakal le ku agrupados tumen separado tu superior le dendrograma (Figura 1I). Le túumben secuencia ts'o'ok u ts'a'abal ti' le k'oja'ano'obo' u datos NCBI yéetel u k'aaba' "Sclerotinia sclerotiorum - aislar YN-25" (GenBank accession number PV202792). Je'el u páajtal u yila'al u le aislado 3 leti' le aislado asab invasivo; le beetike', le aisladoa' yéeya'ab uti'al u xak'alta'al ti' tuláakal le experimentos ku taalo'obo'.
Le actividad antibacteriana ti' le diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) ti' jejeláas concentraciones (12.5, 25, 50, 75, 100 yéetel 125 mg leti' L) xu'ullsa'al S. sclerotiorum aislado 3 bin investigada in vitro. K'a'ana'an u ya'ala'ale' le L-ornitina tu beetaj jump'éel efecto antibacteriano yéetel jujump'íitil tu jets'aj u nojochtal radial ti' le hifas S. sclerotiorum ti' jump'éel bix dependiente ti' le dosis (yoochel 2A, B). Ti' le asab ka'anal concentración probada (125 mg leti' L), L-ornitina demostró le asab ka'anal tasa inhibición tuméen micelial (99.62 ± 0.27%; yoochel 2B), ba'ax ka'ach equivalente ti' le fungicida comercial Rizolex-T (tasa inhibición 99.45 ± 0.39%; 2C) ti' le ka'anal concentración probada (10 mg leti' L), yoochel 2B C) ti' le ka'anal concentración probada (10 mg leti' L). ku ye'esik jump'éel eficacia similar.
Figura 2. In vitro actividad antibacteriana ti' L-ornithine xu'ullsa'al Sclerotinia sclerotiorum. (A) Comparación u actividad antibacteriana u jejeláas concentraciones L-ornitina xu'ullsa'al S. sclerotiorum yéetel le fungicida comercial Rizolex-T (10 mg leti' L). (B, C) Tasa u inhibición (%) u tuméen micelial S. sclerotiorum ka' u Ts'a'akal yéetel jejeláas concentraciones L-ornitina (12.5, 25, 50, 75, 100 yéetel 125 mg leti' L) wa Rizolex-T (2, 4, 6, 8 yéetel 10 mg leti' L), respectivamente. Le ba'alo'ob ku chíikbesiko'ob u chúumuk ± SD ti' Kanp'éel réplicas biológicas (n = 5). Jejeláas letra'ob ku ye'esik u jela'anil estadística ichil le tratamientos (p < 0.05). (D, E) Análisis u regresión modelo probit ti' L-ornitina yéetel fungicida comercial Rizolex-T, respectivamente. Le internet ichil regresión modelo probit ku ye'esik bey juntúul internet ichil azul sólido, yéetel le intervalo confianza (95%) ku ye'esik bey juntúul internet ichil roja discontinua.
Beyxan, u beeta'al jump'éel análisis u regresión probit yéetel le gráficos correspondientes ku muestran ti' le cuadro 1 yéetel le figuras 2D, E. Tu kóom t'aan, le je'o' pendiente aceptable (y = 2.92x − 4.67) yéetel estadísticas significativas asociadas (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 yéetel p < 0.0001; yoochel 2D) u L-ornitina indicaron jump'éel actividad antifúngica mejorada xu'ullsa'al le sclerocomercial fungicida Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 yéetel p < 0.0001) (Tabla 1).
Cuadro 1. Valores u chúumuk concentración inhibidora máxima (IC50) yéetel IC99 (mg leti' l) u L-ornitina yéetel fungicida comercial "Rizolex-T" xu'ullsa'al S. sclerotiorum.
Tu general, L-ornitina (250 mg leti' L) redujo significativamente le ma'alo'ob yéetel gravedad le moho sak ti' le páak'alo'obo' habas común tratadas ti' comparación yéetel le páak'alo'obo' infectadas yéetel S. sclerotiorum ma' tratadas (kaambalil yo'osal; yoochel 3A). Tu kóom t'aan, kex u gravedad le k'oja'anil ti' le páak'alo'obo' kaambalil yo'osal infectadas ma' tratadas aumentó jujump'íitil (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, yéetel 92.33 ± 3.06%), L-ornitina redujo significativamente le gravedad le k'oja'anil (%) ichil le experimento (8.97 ± 1.05, 8.00 ± .00, 1.00, yéetel 1.00, 26.36 ± 3.07) ti' 7, 14, yéetel 21 k'iino'ob ka' u ts'aak (dpt), respectivamente (yoochel 3A). Bey xan, ka le páak'alo'obo' habas infectadas yéetel S. sclerotiorum bino'ob tratadas yéetel 250 mg leti' L L-ornitina, le yo'osal yáanal le curva progresión le k'oja'anil (AUDPC) disminuyó u 1274.33 ± 33.13 ti' le kaambalil yo'osal ma' tratado u 281.03 ± 7.95, ba'ax ka'ach menor u le kaambalil yo'osal 05 mg/L fungicida Rizolex-T (183.61 ± 7.71; Fig. 3B). Le bak'paach tendencia bin u observada ti' le segunda experimento.
Fig. 3. Efecto u ka'anatako'ob exógena u L-ornitina ti' le ma'alo'ob le putrefacción sak u haba común causada tumen Sclerotinia sclerotiorum yáanal condiciones invernadero. (A) Curva u progresión le k'oja'anil ti' moho sak u haba común ka' u Ts'a'akal yéetel 250 mg leti' L L-ornitina. (B) Yo'osal yáanal le curva progresión le k'oja'anil (AUDPC) u moho sak u haba común ka' u Ts'a'akal yéetel L-ornitina. Le ba'alo'ob ku chíikbesiko'ob u chúumuk ± SD ti' Kanp'éel réplicas biológicas (n = 5). Jejeláas letras ku ye'esik u jela'anil estadísticamente significativas ichil le tratamientos (p < 0.05).
U ts'a'abal 250 mg/L L-ornitina tu beetaj u ya'abtal u ka'anlil le páak'alo' (Fig. 4A), meyaj ku u k'ab tumen páak'alo' (Fig. 4B), yéetel meyaj ku u le' tumen páak'alo' (Fig. 4C) ka' 42 k'iino'ob. Ka' jo'op' u le fungicida comercial Rizolex-T (50 mg leti' L) yaan ka'ach le asab efecto ti' tuláakal le parámetros nutricionales estudiados, ka'anatako'ob exógena u 250 mg leti' L L-ornitina yaan ka'ach le segunda asab efecto ti' comparación yéetel le kaambalilo'ob ma' tratados (Figs. 4A-C). Ba'axten otra parte, le Ts'a'akal L-ornitina mina'an ka'ach mix jump'éel efecto significativo ti' le contenido pigmentos fotosintéticos clorofila jump'éel (Fig. 4D) yéetel clorofila b (Fig. 4E), ba'ale' ligeramente aumentó le contenido carotenoides total (0.56 ± 0.03 mg leti' g fr wt) ti' comparación yéetel le kaambalil yo'osal negativo (0.40 ± 0.04 leti' g fr wt) yéetel positivo kaambalil yo'osal (0.46 ± 0.02 mg leti' g fr wt; Fig. 4F). Tu general, le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob indican u L-ornitina ma' le fitotóxica utia'al u legumbres tratadas yéetel páajtal estimular u tuméen.
Fig. 4. Efecto u ka'anatako'ob L-ornitina exógena ti' le características tuméen yéetel pigmentos fotosintéticos u le' haba infectadas yéetel Sclerotinia sclerotiorum yáanal condiciones invernadero. (A) Ka'anilo' le páak'alo' (cm), (B) Meyaj ku k'ab tumen páak'alo', (C) Meyaj ku le' tumen páak'alo', (D) Contenido clorofila a (mg g-1 fr wt), (E) Contenido clorofila b (mg g-1 fr wt), (F) Contenido total ti' carotenoides (mg g-1 fr wt). Le ba'alo'ob ku taasik le promedio ± SD ti' Kanp'éel réplicas biológicas (n = 5). Jejeláas letras ku ye'esik jela'anil estadísticamente significativa ichil le tratamientos (p < 0.05).
Le localización histoquímica in situ ti' le especies oxígeno reactivo (ROS; expresado bey peróxido de hidrógeno [H2O2]) yéetel le radicales libres (expresados ​​bey aniones superóxido [O2•−]) reveló u ka'anatako'ob exógena ti' L-ornitina (250 mg leti' L) redujo significativamente le acumulación H (250 ± O2535 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) yéetel O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) ti' comparación yéetel le acumulación ti' le ka'ap'éel paak'alo'ob infectadas ma' tratadas (173.31 ± 12.06 yéetel 149.35 ± 7.94 nl−1 FW) respectivamente yéetel páak'alo' tratada mg/L ti' le fungicida comercial Rizolex-T (170.12 ± 9.50 yéetel 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, respectivamente) ti' 72 h. Ka'anal niveles u H2O2 yéetel O2•− acumulados yáanal hpt (Fig. 5A, B). Bey xan, le ensayo malondialdehído (MDA) basado ti' TCA tu ye'esaj u le páak'alo'obo' habas infectadas yéetel S. sclerotiorum acumularon niveles asab ka'anatako'ob u MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) ti' u le' (Fig. 5C). Ba'ale', le ka'anatako'ob exógena ti' L-ornitina redujo significativamente le peroxidación lipídica bey evidenciado tumen le disminución ti' le contenido MDA ti' le páak'alo'obo' tratadas (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Efecto u ka'anatako'ob L-ornitina exógena ti' le k'ajle' marcadores estrés oxidativo yéetel mecanismos defensa antioxidante ma' enzimático ti' le' haba infectadas yéetel S. sclerotiorum ti' 72 h post-infección yáanal condiciones invernadero. (A) Peróxido de hidrógeno (H2O2; nmol g−1 FW) ti' 72 hpt, (B) anión superóxido (O2•−; nmol g−1 FW) ti' 72 hpt, (C) malondialdehído (MDA; nmol g−1 FW) ti' 72 hpt, (D) fenol total soluble (GA) ti' 7− g−7 FW hpt, (E) total flavonoides solubles (mg RE g−1 FW) ti' 72 hpt, (F) total aminoácidos libres (mg g−1 FW) ti' 72 hpt, yéetel (G) contenido prolina (mg g−1 FW) ti' 72 hpt. Le ba'alo'ob ku chíikbesiko'ob le promedio ± desviación estándar (promedio ± SD) ti' 5 réplicas biológicas (n = 5). Jejeláas letras ku ye'esik jela'anil estadísticamente significativa ichil le tratamientos (p < 0.05).