Ka'ache' k ts'áaj ojéeltbil u le niveles séricos ti' le metabolito triptófano derivado ti' le intestino ácido indole-3-propiónico (IPA) ku asab bajos ti' le k'oja'ano'ob yéetel fibrosis hepática. Te' xook je'ela', investigamos le transcriptoma yéetel le metiloma ADN ti' le hígados obesos en relación con le niveles IPA séricos, bey le ju'uno' le IPA ti' le inducción inactivación fenotípica ti' le células esteladas hepáticas (HSCs) in vitro.
Le xooko' tu táakbesaj 116 k'oja'ano'ob obesos xma' diabetes mellitus bin yano'ob 2 (T2DM) (ts'o'oka'an 46.8 ± 9.3 ja'abo'ob; IMC: 42.7 ± 5.0 kg leti' m2) ku sometieron ti' cirugía bariátrica ti' le Centro u Cirugía Bariátrica u Kuopio (KOBS). Le niveles IPA circulantes bino'ob medidos tumen cromatografía líquida-espectrometría u juuch' (LC-MS), análisis transcriptoma hepático u realizó tumen secuenciación ARN total, ka análisis metilación ADN u realizó utilizando le Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Células esteladas hepáticas humanas (LX-2) u utilizaron utia'al u experimentos in vitro.
Le niveles IPA séricos correlacionados yéetel le expresión genes involucrados ti' le vías apoptóticas, mitofágicas yéetel longevidad ti' le táaman. Le gen AKT serina leti' treonina quinasa 1 (AKT1) bin le gen interactuando asab abundante yéetel dominante ti' le transcripción hepática yéetel le perfiles metilación ADN. Ts'a'akal IPA indujo apoptosis, disminución le respiración mitocondrial, ka alteró le morfología celular yéetel le dinámica mitocondrial tumen modular le expresión genes k'ajóolta'ano'ob tumen regular le fibrosis, apoptosis yéetel supervivencia le células LX-2.
Tu láakal, le k'iino'oba' datos apoyan u IPA yaan u táanil terapéuticos potenciales yéetel je'el inducir apoptosis yéetel desplazar le fenotipo HSC ti' jump'éel noj inactivo, expandiendo bey u posibilidad u inhibición le fibrosis hepática interfiriendo yéetel le activación HSC yéetel le metabolismo mitocondrial.
U ya'abtal le obesidad yéetel le síndrome metabólico u ts'o'ok asociado yéetel juntúul creciente incidencia le k'oja'anil hepática grasa asociada metabólicamente (MASLD); le k'oja'anila' ku loobiltik 25% tak 30% ti' tuláakal u kajnáalilo'ob [1]. Le consecuencia noj bejo' u etiología MASLD jach le fibrosis hepática, jump'éel tuukula' dinámico caracterizado tumen le acumulación continua u matriz extracelular fibrosa (ECM) [2]. Le células k'ajle' ku táakpajalo'ob ti' le fibrosis hepática le células esteladas hepáticas (HSCs), ku ye'esik kantúul fenotipos k'ajóolta'ano'ob: quiescente, activado, inactivado yéetel senescente [3, 4]. HSCs páajtal u activados yéetel transdiferenciados ti' jump'éel bix quiescente ti' células proliferativas bey fibroblastos yéetel ka'anal demandas energía, yéetel aumento ti' le expresión actina α-músculo liso (α-SMA) yéetel colágeno bin yano'ob I (Col-I) [5, 6]. ichil u k'eexpajal le fibrosis hepática, le HSCs activados ku eliminan yo'osal le apoptosis wa inactivación. Le k'iino'oba' procesos incluyen downregulation ti' le genes fibrogénicos yéetel modulación ti' le genes prosupervivencia (bey NF-κB yéetel PI3K leti' Akt vías señalización) [7, 8], bey cambios ti' le dinámica yéetel le función mitocondrial [9].
Le niveles séricos ti' le metabolito triptófano ácido indole-3-propiónico (IPA), producido ti' le intestino, u Kaxa'antbil u disminuido ti' le k'aas k'oja'anilo'obo' metabólicas humanas incluyendo MASLD [10-13]. IPA u asocia yéetel le ingesta láaj jo'ochiko'obe' dietética, leti'e' k'ajóolta'an tumen u táanil antioxidantes yéetel antiinflamatorios, ka atenua le fenotipo esteatohepatitis ma' alcohólica inducida tumen le dieta (NASH) in vivo yéetel in vitro [11-14]. Yaan ba'alo'ob ku taal ti' k xook máaniko', tu'ux tu ye'esaj u le niveles IPA ti' suero bino'ob asab bajos ti' le k'oja'ano'ob yéetel fibrosis hepática u ti' le k'oja'ano'ob obesos xma' fibrosis hepática ti' le xooko' cirugía bariátrica Kuopio (KOBS). Beyxan, k demostramos u Ts'a'akal IPA je'el u páajtal u xu'ulsiko'ob u expresión le genes ku marcadores clásicos ti' le adherencia celular, migración celular yéetel activación células na' hematopoyéticas ti' jump'éel bix u célula estelada hepática humana (LX-2) yéetel jach jump'éel metabolito hepatoprotector potencial [15]. Ba'ale', ma' jach ojéela'an bix u beetik u IPA u regresión le fibrosis hepática yo'osal u activación le apoptosis HSC yéetel le bioenergética mitocondrial.
Te'ela', k demostramos u IPA sérico u asocia yéetel le expresión genes enriquecidos ti' apoptosis, mitofagia, yéetel vías longevidad ti' le táaman individuos obesos Ba'ale' ma' diabetes bin yano'ob 2 (KOBS). Beyxan, k encontramos u IPA je'el u páajtal u inducir le limpieza yéetel degradación le células na' hematopoyéticas activadas (HSCs) yo'osal le bejo' inactivación. Le ba'ax ku yila'ala' ku ye'esik jump'éel túumben meyaj uti'al IPA, ku beetik u jump'éel potencial objetivo terapéutico uti'al u yáanta'al u regresión le fibrosis hepática.
jump'éel xook ts'o'ok u máan ti' le cohorte KOBS tu ye'esaj u le k'oja'ano'ob yéetel fibrosis hepática yaan ka'ach niveles IPA circulantes asab bajos ti' comparación yéetel le k'oja'ano'ob xma' fibrosis hepática [15]. Utia'al u p'atik le efecto confuso potencial ti' le diabetes bin yano'ob 2, reclutamos 116 k'oja'ano'ob obesos xma' diabetes bin yano'ob 2 (ts'o'oka'an promedio ± SD: 46.8 ± 9.3 ja'abo'ob; IMC: 42.7 ± 5.0 kg leti' m2) (Tabla 1) ti' le xooko' KOBS continuo bey le jo'olkaajo' xook [16]. Tuláakal le máaxo'ob táakpajalo'obo' tu ts'áajo'ob u consentimiento informado tumen ts'íib yéetel le protocolo xook bin aprobado tumen le Comité Ético ti' le Hospital Condado u Xaman Savo de acuerdo con le Declaración u Helsinki (54/2005, 104/2008 yéetel 27/2010).
Le muestras biopsia hepática bino'ob obtenidas ichil le cirugía bariátrica yéetel histológicamente evaluadas tumen patólogos experimentados bin criterios descritos ka'achij [17, 18]. Le criterios evaluación ku resumen ti' le tabla suplementaria S1 yéetel u séen descrito ka'achij [19].
Le muestras suero ti' ayuno bino'ob analizadas tumen cromatografía líquida ma' dirigida-espectrometría u masas (LC-MS) utia'al u análisis metabolómico (n = 116). Le muestras bino'ob analizadas utilizando juntúul t.u.m UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Alemania) bey descrito anteriormente19. U k'ajóolta'al le alcohol isopropílico (IPA) ku basa ti' le k'iin retención yéetel le comparación le espectro MS leti' MS yéetel estándares puros. Le intensidad señal IPA (yo'osal u pico) bin considerada ti' tuláakal le análisis asab táanil [20].
U secuenciación u ARN u táaman entero u realizó utilizando Illumina HiSeq 2500 yéetel le datos bino'ob preprocesados ​​bey descrito ka'achij [19, 21, 22]. K meentik jump'éel análisis expresión diferencial dirigida ti' le transcripciones ku afectan le función mitocondrial leti' biogénesis utilizando 1957 genes seleccionados ti' le k'oja'ano'obo' u datos MitoMiner 4.0 [ 23 ]. U xak'alil u metilación u ADN u táaman u beeta'al utilizando le Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) utilizando le bak'paach metodología bey descrito ka'achij [24, 25].
Le células esteladas hepáticas humanas (LX-2) bino'ob amablemente proporcionadas tumen le Prof. Stefano Romeo yéetel bino'ob cultivadas yéetel mantenidas ti' chúumuk DMEM leti' F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen leti' Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 100-17-16). Utia'al u yéeyik le dosis meyaj IPA, le células LX-2 bino'ob tratadas yéetel jejeláas concentraciones IPA (10 μM, 100 μM yéetel 1 mM; Sigma, 220027) ti' chúumuk DMEM leti' F12 ichil 24 h. Beyxan, uti'al u xak'alta'al u páajtalil IPA u inactivar le HSCs, le células LX-2 bino'ob co-tratadas yéetel 5 ng leti' ml TGF-β1 (R & Mulix sistemas, 240-B-002 leti' CF) yéetel 1 mM IPA ti' chúumuk libre u suero ichil 24 h. Utia'al le kaambalilo'ob vehículo correspondientes, 4 nM HCL ku taasik 0.1 ti chúumuk BSA bin utilizado utia'al u Ts'a'akal TGF-β1 yéetel 0.05 ti chúumuk DMSO bin utilizado utia'al u Ts'a'akal IPA, ka ambas bino'ob utilizadas múuch' utia'al u Ts'a'akal combinación.
Le apoptosis bin evaluada utilizando le FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit yéetel 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat # 640922) bin le t'aano'ob le fabricante. Tu kóom t'aan, LX-2 (1 × 105 células leti' ch'e'eno') bino'ob cultivados ichil áak'ab ti' placas 12-ch'e'eno' ka tu láak' tratados yéetel ya'ab k'oja'ano'ob dosis IPA wa IPA yéetel TGF-β1. Tu láak' k'iin, le células flotantes yéetel adherentes bino'ob recogidas, tripsinizadas, lavadas yéetel PBS, resuspendidas ti' tampón unión anexina V, ka incubadas yéetel FITC-anexina V yéetel 7-AAD ichil 15 min.
Le mitocondrias ti' le células kuxa'ano'obo' bino'ob manchadas utia'al u actividad oxidativa utilizando MitotrackerTM Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Utia'al u ensayos MTR, le células LX-2 bino'ob incubadas ti' densidades iguales yéetel IPA yéetel TGF-β1. Ka' 24 h, le células kuxa'ano'ob bino'ob tripsinizadas, lavadas yéetel PBS, ka tu láak' incubadas yéetel 100 μM MTR ti' chúumuk libre u suero ti' 37 ° C ichil 20 min bey descrito ka'achij [ 26 ]. Utia'al u análisis u morfología le células kuxa'an, Buka'aj le células yéetel le complejidad citoplasmática bino'ob analizados utilizando parámetros dispersión tak táanil (FSC) yéetel dispersión lateral (SSC), respectivamente.
Tuláakal le datos (30,000 k'inbesajo'ob) bino'ob adquiridos utilizando NovoCyte Quanteon (Agilent) yéetel analizados utilizando software NovoExpress® 1.4.1 wa FlowJo V.10.
Le tasa u jantbil oxígeno (OCR) yéetel le tasa acidificación extracelular (ECAR) bino'ob medidas tu k'iinil xíimbal tumen utilizando jump'éel analizador flujo extracelular Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipado yéetel juntúul Seahorse XF Cell Mito Stress bin le t'aano'ob le fabricante. Tu kóom t'aan, 2 × 104 células LX-2 leti' ch'e'eno' bino'ob sembradas ti' placas cultivos celulares XF96. Ka' ts'o'ok u incubación ichil áak'ab, le células bino'ob tratadas yéetel isopropanol (IPA) yéetel TGF-β1 (Métodos suplementarios 1). U xak'alil le datoso' beeta'ab yéetel le software Seahorse XF Wave, tu'ux ku táakbesik le Generador de informes de prueba fenotipo de energía celular Seahorse XF. Ti' le ba'ala', u calculó jump'éel índice toj bioenergético (BHI) [27].
tuláakal le ARN ku ts'íibta'al ti' cDNA. Utia'al u métodos específicos, wil le referencia [15]. Le niveles mRNA proteína ácida ribosomal 60S humana P0 (RPLP0) yéetel ciclofilina A1 (PPIA) u utilizaron bey kaambalilo'ob genéticos constitutivos. Le QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, The Netherlands) bin utilizado yéetel le TaqMan TM Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) wa le Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), yéetel le expresión genética relativa bin u calculada utilizando le je'o' comparativo utilizando cyc parámetros (ΔΔCt) yéetel le método ∆∆Ct. U tsoolil le cebador ku ts'aik ti' le tablas suplementarias S2 yéetel S3.
ADN nuclear (ncDNA) yéetel ADN mitocondrial (mtDNA) bino'ob extraídos utilizando le kit k'i'ik'el yéetel wa'ak'al DNeasy (Qiagen) bey descrito ka'achij [28]. Le cantidad relativa ti' mtDNA bin calculada tumen cálculo le relación Amal región mtDNA objetivo ti' le promedio geométrico ti' le óoxp'éel regiones ADN nuclear (mtDNA leti' ncDNA), bey detallado ti' le métodos suplementarios 2. Detalles le cebadores utia'al u mtDNA yéetel ncDNA ku proporcionan ti' le tabla suplementaria S4.
Le células kuxa'ano'obo' bino'ob manchadas yéetel MitotrackerTM Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) uti'al u yila'al le redes mitocondriales intercelulares yéetel intracelulares. Le células LX-2 (1 × 104 células leti' ch'e'eno') bino'ob cultivadas ti' diapositivas vidrio ti' placas cultivos correspondientes u fondo vidrio (Ibidi GmbH, Martinsried, Alemania). Ka' 24 h, células LX-2 kuxa'ano'ob bino'ob incubadas yéetel 100 μM MTR ichil 20 min ti' 37 ° C yéetel núcleos celulares bino'ob manchados yéetel DAPI (1 μg leti' ml, Sigma-Aldrich) bey descrito ka'achij [29]. Le páawo'ob mitocondriales bino'ob visualizadas utilizando jump'éel microscopio invertido Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemania) equipado yéetel juntúul módulo confocal Zeiss LSM 800 ti' 37 ° C ti' jump'éel atmósfera humedecida yéetel 5 ti chúumuk CO2 utilizando jump'éel objetivo 63 × NA 1.3. K ch'a'aj lajuntúul máak ti' le serie Z uti'al Amal bin yano'ob muestra. Amal serie Z ku taasik 30 jaatso'ob, jujuntúulal yéetel jump'éel espesor 9.86 μm. Utia'al Amal muestra, máak u lajuntúul jejeláas sikte u visión bino'ob adquiridas utilizando software ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemania), yéetel análisis morfología mitocondrial u realizó utilizando software ImageJ (v1.54d) [30, 31] bin le parámetros detallados ti' le métodos suplementarios 3.
Le células bino'ob fijadas yéetel 2% glutaraldehído ti' 0.1 M tampón fosfato, seguido tumen fijación yéetel 1% solución tetróxido ósmio (Sigma Aldrich, MO, USA), jujump'íitil deshidratadas yéetel acetona (Merck, Darmstadt, Alemania), ka finalmente incrustadas ti' u yiits epoxi. Jaatso'ob ultrafinas bino'ob preparadas yéetel manchadas yéetel 1% acetato uranilo (Merck, Darmstadt, Alemania) yéetel 1% citrato plomo (Merck, Darmstadt, Alemania). Le oochelo'ob ultraestructurales bino'ob obtenidas utilizando jump'éel microscopio electrónico u transmisión JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokio, Japón) ti' jump'éel voltaje aceleración u 80 kV.
U morfología le células LX-2 tratadas yéetel IPA ichil 24 h bin u analizada tumen microscopía contraste fase ti' 50 x aumento utilizando jump'éel microscopio sáasil invertida Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 yéetel AxioCam MRm, Jena, Alemania).
Le datos clínicos bino'ob expresados ​​bey promedio ± desviación estándar wa mediana (rango intercuartílico: IQR). Utia'al u comparar u jela'anil ichil le óoxp'éel múuch' xooko'obo', meyajnaj análisis unidireccional ti' le varianza (variables continuas) wa prueba χ2 (variables categóricas). Le tasa falso positivo (FDR) bin utilizado utia'al u corregir utia'al u ya'ab k'oja'ano'ob pruebas, ka genes yéetel FDR < 0.05 bino'ob considerados estadísticamente significativos. U análisis u correlación Spearman u utilizado utia'al u correlacionar le metilación ADN CpG yéetel intensidad señal IPA, yéetel valores p nominales (p < 0.05) informados.
U xak'alil u bejil u beeta'al yéetel jump'éel nu'ukula' u xak'alil u múuch' genes basado ti' web (WebGestalt) uti'al 268 transcripciones (nominal p < 0.01), 119 transcripciones asociadas yéetel mitocondrias (nominal p < 0.05), yéetel 4350 CpGs ti' 3093 transcripciones hepáticas ku bino'ob asociadas yéetel niveles IPA circulantes ti' suero. Le nu'ukula' Venny DB (versión 2.1.0) libremente disponible bin utilizada utia'al u kaxtik genes superpuestos, ka StringDB (versión 11.5) bin utilizada utia'al u visualizar le interacciones proteína-proteína.
Utia'al u experimento LX-2, le muestras bino'ob probadas utia'al u normalidad utilizando le prueba D'Agostino-Pearson. Le datos bino'ob obtenidos ti' Ba'axten lo bey óoxp'éel réplicas biológicas yéetel sometidos ti' ANOVA unidireccional yéetel prueba post hoc u Bonferroni. jump'éel p-value menos u 0.05 bin considerado estadísticamente significativo. Le datos ku ye'esa'al bey promedio ± SD, yéetel le meyaj ku experimentos ku indica ti' Amal figura. Tuláakal le análisis yéetel le gráficos ku beeta'al yéetel GraphPad Prism 8 software estadístico uti'al Windows (GraphPad Software Inc., versión 8.4.3, San Diego, USA).
Yáax, investigamos le asociación niveles IPA sérico yéetel táaman, tuláakal u wíinkilal, yéetel transcripciones mitocondriales. Ti' le perfil transcripción total, le gen asab k'a'am asociado yéetel le niveles IPA sérico bin MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; proteína quinasa activada tumen mitógeno-activada proteína quinasa 3); ti' le perfil transcripción relacionada yéetel le mitocondrias, le gen asociado asab k'a'am bin AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serina leti' treonina quinasa 1) (Archivo adicional 1 yéetel archivo adicional 2).
Tu láak' analizamos le transcripciones globales (n = 268; p < 0.01) yéetel le transcripciones asociadas yéetel le mitocondrias (n = 119; p < 0.05), tu ts'ook instancia identificamos le apoptosis bey le bejo' canónico asab significativo (p = 0.0089). Utia'al u transcripciones mitocondriales asociadas yéetel le niveles IPA séricos, k centramos ti' le apoptosis (FDR = 0.00001), mitofagia (FDR = 0.00029), yéetel vías señalización TNF (FDR = 0.000006) (Figura 1A, Tabla 2, yéetel Figuras Suplementarias 1-B).
Análisis superpuesto ti' le transcripciones globales, asociadas yéetel le mitocondrias, yéetel le metilación ADN ti' le táaman humano ti' asociación yéetel le niveles IPA sérico. A ku chíikbesik 268 transcripciones globales, 119 transcripciones asociadas yéetel mitocondrias, yéetel transcripciones metiladas u ADN ku mapean ti' 3092 lu'umo'oba' CpG asociados yéetel niveles IPA séricos (valores p < 0.01 utia'al u transcripciones globales yéetel ADN metilado, yéetel valores p < 0.00 utia'al u transcripción mitocondrial). Le k'ajle' transcripciones superpuestas ku muestran tu chúumukil (AKT1 yéetel YKT6). B Le mapa interacción ti' le 13 genes yéetel le asab ka'anal puntuación interacción (0.900) yéetel uláak' genes bin construido ti' le 56 genes superpuestos (región internet ichil negra) ku bino'ob significativamente asociados yéetel le niveles IPA sérico utilizando le nu'ukula' ti' internet ichil StringDB. Ya'ax: Genes mapeados ti' le Ontología Genética (GO) componente celular: mitocondrias (GO:0005739). AKT1 leti' le proteína yéetel le asab ka'anal puntuación (0.900) utia'al u interacciones yéetel uláak' proteínas basadas ti' le datos (basadas ti' minería analte'o', experimentos, k'oja'ano'obo' u datos, yéetel coexpresión). Le nodos páawo'ob ku chíikbesiko'ob le proteínas, yéetel le bordes ku chíikbesiko'ob le conexiones ichil le proteínas.
Tuméen le metabolitos microbiota intestinal páajtal regular le composición epigenética yo'osal le metilación ADN [32], investigamos wa le niveles IPA séricos bino'ob asociados yéetel le metilación ADN hepático. K encontramos u le ka'ap'éel k'ajle' kúuchilo'ob metilación asociados yéetel le niveles IPA sérico bino'ob naats' le región 3 ayik'al ti' prolina-serina (C19orf55) yéetel choque térmico proteína ch'i'ibalil B (chan) miembro 6 (HSPB6) (Archivo adicional 3). Le metilación ADN ti' 4350 CpG (p < 0.01) bin correlacionada yéetel le niveles IPA sérico yéetel bin enriquecida ti' vías reguladoras u longevidad (p = 0.006) (yoochel 1A, tabla 2, yéetel yoochel suplementaria 1C).
Utia'al u entender le mecanismos biológicos subyacentes ti' le asociaciones ichil le niveles IPA sérico, transcripciones globales, transcripciones asociadas yéetel mitocondrias, yéetel metilación ADN ti' táaman humano, realizamos jump'éel análisis superposición ti' le genes identificados ti' le análisis bejil anterior (yoochel 1A). Ya'ala'al máaxo'ob máano'ob u análisis u enriquecimiento le bejo' ti' le 56 genes superpuestos (ichil le internet ichil negra ti' le yoochel 1A) mostraron u le bejo' apoptosis (p = 0.00029) destacó ka'ap'éel genes náats'al ti' le óoxp'éel análisis: AKT1 yéetel YKT6 (YKT6 v-SNARE homólogo), bey ku ye'esik ti' le diagrama Venuppleary yéetel le yoochel 2A 1A). Jach jats'uts, k encontramos u AKT1 (cg19831386) yéetel YKT6 (cg24161647) bino'ob positivamente correlacionados yéetel le niveles IPA sérico (Archivo adicional 3). Utia'al u identificar le interacciones proteínas potenciales ichil le yik'áalil genéticos, seleccionamos 13 genes yéetel le asab ka'anal puntuación región común (0.900) ichil 56 genes superpuestos bey entrada yéetel construimos jump'éel mapa interacción. Bin le nivel confianza (confianza marginal), le gen AKT1 yéetel le asab puntuación (0.900) bin tu superior (yoochel 1B).
Yóok'ol le análisis bejo', k encontramos u le apoptosis bin le bejo' noj bejo', bey u investigamos wa le Ts'a'akal IPA afectaría le apoptosis HSCs in vitro. Ka'ache' k demostrado u jejeláas dosis IPA (10 μM, 100 μM, yéetel 1 mM) ma' bino'ob tóxicos utia'al u células LX-2 [15]. Le xooko' tu ye'esaj u Ts'a'akal IPA ti' 10 μM yéetel 100 μM aumentó le meyaj ku células viables yéetel necróticas. Ba'ale', ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal, le viabilidad celular disminuyó ti' 1 mM concentración IPA, ka' jo'op' u le tasa necrosis celular permaneció xma' cambios (yoochel 2A, B). Tu láak', uti'al u kaxtik le concentración óptima uti'al u inducir le apoptosis ti' le células LX-2, probamos 10 μM, 100 μM, yéetel 1 mM IPA ichil 24 h (yoochel 2A-E yéetel figura suplementaria 3A-B). Jach jats'uts, IPA 10 μM yéetel 100 μM disminuyeron le tasa apoptosis (%), Ba'ale', IPA 1 mM aumentó le apoptosis tardía yéetel le tasa apoptosis (%) ti' comparación yéetel le kaambalil yo'osal ka tune' bin yéeyik utia'al u asab experimentos (Figuras 2A-D).
IPA ku beetik u kíimil le células LX-2. Anexina V yéetel 7-AAD doble tinción método u utilizado utia'al u cuantificar le tasa apoptótica yéetel le morfología celular tumen citometría flujo. Le células BA bino'ob incubadas yéetel 10 μM, 100 μM yéetel 1 mM IPA ichil 24 h wa yéetel F-H TGF-β1 (5 ng leti' ml) yéetel 1 mM IPA ti' chúumuk libre u suero ichil 24 h. A: células kuxa'ano'ob (Anexin V -/ 7AAD-); B: células necróticas (Anexin V -/ 7AAD+); C, F: temprano (Anexin V +/ 7AAD-); D, G: tarde (Anexin V+/7AAD.+); E, H: porcentaje u total le células apoptóticas tempranas yéetel tardías ti' le tasa apoptótica (%). Le datos ku expresan bey promedio ± SD, n = 3 experimentos independientes. Le comparaciones estadísticas u realizaron utilizando ANOVA unidireccional yéetel prueba post hoc u Bonferroni. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Bix ts'o'ok k demostrado ka'achij, 5 ng leti' ml TGF-β1 je'el u páajtal u inducir le activación HSC yo'osal u ya'abtal le expresión genes marcadores clásicos [15]. Le células LX-2 bino'ob tratadas yéetel 5 ng leti' ml TGF-β1 yéetel 1 mM IPA ti' combinación (Fig. 2E-H). Ts'a'akal TGF-β1 ma' tu k'exaj u tasa le apoptosis, ba'ale', le co-Ts'a'akal IPA aumentó le apoptosis tardía yéetel le tasa apoptosis (%) ti' comparación yéetel le Ts'a'akal TGF-β1 (Fig. 2E-H). Le ba'ax ku yila'ala' ku ye'esik u 1 mM IPA je'el u páajtal u promover le apoptosis ti' le células LX-2 independientemente ti' le inducción TGF-β1.
K investigamos asab táanil le efecto IPA ti' le respiración mitocondrial ti' le células LX-2. Le ba'ax ku yila'alo' tu ye'esaj u 1 mM IPA disminuyó le parámetros tasa jant p'áatalij oxígeno (OCR): respiración ma' mitocondrial, respiración basal yéetel máxima, fuga protones yéetel producción ATP ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal (yoochel 3A, B), ka' jo'op' u le índice toj bioenergético (BHI) ma' k'expajal.
IPA ku xu'ulsik u respiración mitocondrial ti' le células LX-2. Le curva respiración mitocondrial (OCR) ku ye'esik bey parámetros respiración mitocondrial (respiración ma' mitocondrial, respiración basal, respiración máxima, fuga protones, generación ATP, SRC yéetel BHI). Le células A yéetel B bino'ob incubadas yéetel 10 μM, 100 μM yéetel 1 mM IPA ichil 24 h, respectivamente. Le células C yéetel D bino'ob incubadas yéetel TGF-β1 (5 ng leti' ml) yéetel 1 mM IPA ti' chúumuk libre u suero ichil 24 h, respectivamente. Tuláakal le mediciones bino'ob normalizadas ti' le contenido ADN utilizando le kit CyQuant. BHI: índice toj bioenergético; SRC: Buka'aj u ba'al u reserva respiratoria; OCR: tasa u jant p'áatalij oxígeno. Le datos ku ye'esa'al bey promedio ± desviación estándar (DE), n = 5 experimentos independientes. Le comparaciones estadísticas u realizaron utilizando ANOVA unidireccional yéetel prueba post hoc u Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; yéetel ***p < 0.001
Utia'al u yantal jump'éel asab na'atil ti' le efecto IPA ti' le perfil bioenergético ti' le células LX-2 activadas tumen TGF-β1, analizamos le fosforilación oxidativa mitocondrial tumen OCR (Fig. 3C, D). Le ba'ax ts'o'ok u yila'alo' tu ye'esaj u Ts'a'akal TGF-β1 je'el u páajtal u xu'ulsiko'ob le respiración máxima, Buka'aj u ba'al u reserva respiratoria (SRC) yéetel BHI ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal (Fig. 3C, D). Beyxan, le Ts'a'akal combinación disminuyó le respiración basal, fuga protones yéetel producción ATP, ba'ale' SRC yéetel BHI bino'ob significativamente asab ka'anatako'ob u le tratados yéetel TGF-β1 (Fig. 3C, D).
Xan k meentik le "Prueba u fenotipo u energía celular" proporcionada tumen software Seahorse (Fig. 4A-D suplementaria). Bix u ye'esik ti' le Fig. 3B suplementaria, le potenciales metabólicos OCR yéetel ECAR disminuyeron ka' u Ts'a'akal TGF-β1, Ba'ale', ma' bin observada jela'anil in ti' le múuch' Ts'a'akal combinación yéetel IPA ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal. Beyxan, le niveles basales yéetel estrés ti' OCR disminuyeron ka' u combinación yéetel le Ts'a'akal IPA ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal (Fig. 4C suplementaria). Jach jats'uts, jump'éel patrón similar bin u observado yéetel terapia combinación, tu'ux ma' bin observado k'eexpajal ti' le niveles basales yéetel estrés ti' ECAR ti' comparación yéetel le Ts'a'akal TGF-β1 (Fig. 4C suplementaria). Ti' le HSCs, le reducción ti' le fosforilación oxidativa mitocondrial yéetel le Buka'aj u ba'al u Ts'a'akal combinación utia'al u restaurar SCR yéetel BHI ka' u exposición ti' le Ts'a'akal TGF-β1 ma' alteró le potencial metabólico (OCR yéetel ECAR). Tu láakal, le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob indican u IPA je'el xu'ulsiko'ob le bioenergética ti' HSCs, sugiriendo u IPA je'el inducir jump'éel perfil energético asab t'okik ku desplaza le fenotipo HSC ti' le inactivación (Figura suplementaria 4D).
Le efecto IPA ti' le dinámica mitocondrial bin investigado utilizando cuantificación tridimensional ti' le morfología mitocondrial yéetel conexiones páawo'ob bey tinción MTR (yoochel 4 yéetel figura suplementaria 5). Le yoochel 4 ku ye'esik, ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal, le Ts'a'akal TGF-β1 disminuyó le superficie promedio, meyaj ku k'ab, longitud total u k'ab, yéetel meyaj ku unión k'ab (yoochel 4A yéetel B) ka tu k'exaj le proporción mitocondrias u morfología esférica u intermedia (yoochel 4C). Chéen le Ts'a'akal IPA disminuyó le volumen mitocondrial promedio yéetel k'ex le proporción mitocondrias u morfología esférica u intermedia ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal (yoochel 4A). U jela'anil, le esfericidad, le longitud promedio ti' le k'ab, yéetel le actividad mitocondrial evaluada tumen MTR dependiente ti' le potencial ti' le membrana mitocondrial (yoochel 4A yéetel E) permanecieron xma' cambios yéetel le k'iino'oba' parámetros ma' diferían ichil le múuch'o'ob. Tu láakal, le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob sugieren u TGF-β1 yéetel IPA Ts'a'akal aparecen utia'al u modular beyo' yéetel Buka'aj mitocondrial bey complejidad páawo'ob ti' células LX-2 kuxa'an.
IPA ku k'exik u dinámica le mitocondria yéetel u ya'abil le ADN mitocondrial ti' le células LX-2. A. Imágenes confocales representativas u células LX-2 vivas incubadas yéetel TGF-β1 (5 ng leti' ml) yéetel 1 mM IPA ichil 24 h ti' chúumuk libre u suero ku ye'esik redes mitocondriales manchadas yéetel MitotrackerTM Red CMXRos yéetel núcleos manchados azul yéetel DAPI. Tuláakal le datos yaan ka'ach Ba'axten lo bey 15 máak tumen múuch'. K ch'a'aj 10 máak Z-stack uti'al Amal bin yano'ob muestra. Amal secuencia Z-axis yaan ka'ach 30 rodajas, jujuntúulal yéetel juntúul espesor 9.86 μm. Barra de escala: 10 μm. B. Meentiko'ob representativos (chéen mitocondrias) identificados tumen aplicar umbral adaptativo ti' le wíimbala'. Análisis cuantitativo yéetel comparación conexiones páawo'ob morfológica mitocondrial u realizaron utia'al tuláakal le células ti' Amal múuch'. C. Frecuencia u relación beyo' mitocondrial. Le ba'alo'ob naats' ti' 0 ku ye'esik formas esféricas, yéetel le ba'alo'ob naats' ti' 1 ku ye'esik formas filamentosas. D Le contenido ADN mitocondrial (mtDNA) bin determinado bey descrito ti' materiales yéetel métodos. E MitotrackerTM Red CMXRos análisis u realizó tumen citometría flujo (30.000 k'inbesajo'ob) bey descrito ti' materiales yéetel métodos. Le datos ku ye'esa'al bey promedio ± SD, n = 3 experimentos independientes. Le comparaciones estadísticas u realizaron utilizando ANOVA unidireccional yéetel prueba post hoc u Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Tu láak' analizamos le contenido mtDNA ti' células LX-2 bey juntúul indicador u meyaj ku mitocondrial. Ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal, le contenido mtDNA bin u ya'abtal ti' le múuch' tratado yéetel TGF-β1 (yoochel 4D). Ti' comparación yéetel le múuch' tratado yéetel TGF-β1, le contenido mtDNA bin disminuido ti' le múuch' Ts'a'akal combinación (yoochel 4D), sugiriendo u IPA je'el xu'ulsiko'ob le contenido mtDNA yéetel posiblemente le meyaj ku mitocondrial bey respiración mitocondrial (yoochel 3C). Beyxan, IPA parecía xu'ulsiko'ob le contenido mtDNA ti' le Ts'a'akal combinación Ba'ale' ma' afectó le actividad mitocondrial mediada tumen MTR (Figuras 4A-C).
Investigamos le asociación IPA yéetel le niveles mRNA ti' le genes asociados yéetel le fibrosis, apoptosis, supervivencia, yéetel dinámica mitocondrial ti' células LX-2 (yoochel 5A-D). Ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal, le múuch' tratado yéetel TGF-β1 tu ye'esaj aumento ti' le expresión genes bey le tsolokbal α2 bin yano'ob I colágeno (COL1A2), actina α-músculo liso (αSMA), matriz metaloproteinasa 2 (MMP2), inhibidor u wa'ak'al ti' le metaloproteinasa 1 (TIMP1), yéetel 1D (RP1), ku ye'esik genes similares ya'abtal le fibrosis yéetel le activación. Beyxan, ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal, le Ts'a'akal TGF-β1 xu'ulsiko'ob le niveles mRNA ti' le receptor pregnano X nuclear (PXR), caspasa 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibidor ti' le célula B α, potenciador ti' le péptido sáasil gen factor nuclear κ (NFκB1A), yéetel inhibidor ti' le factor nuclear κB quinasa subunidad (Fig 5A-D). Ti' comparación yéetel le Ts'a'akal TGF-β1, le Ts'a'akal combinación yéetel TGF-β1 yéetel IPA redujo le expresión COL1A2 yéetel MMP2, ba'ale' aumentó le niveles mRNA ti' PXR, TIMP1, linfoma B-cell-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, yéetel IKBB. Ts'a'akal IPA disminuyó significativamente le expresión MMP2, Bcl-2-asociada proteína X (BAX), AKT1, proteína atrofia óptica 1 (OPA1), yéetel proteína fusión mitocondrial 2 (MFN2), mientras u le expresión CASP8, NFκB1A, NFκB1B, yéetel IKB bin aumentó ti' comparación yéetel le control B. Ba'ale', ma' bin u yila'al mix jump'éel jela'anil ti' u expresión le caspasa-3 (CASP3), le factor activador u peptidasa apoptótica 1 (APAF1), le proteína fusión mitocondrial 1 (MFN1), yéetel le proteína fisión 1 (FIS1). Tu láakal, le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob sugieren u le Ts'a'akal IPA modula le expresión genes asociados yéetel le fibrosis, apoptosis, supervivencia yéetel dinámica mitocondrial. K datos sugieren u le Ts'a'akal IPA reduce le fibrosis ti' le células LX-2; ti' le k'iino' je'el xano' k'iin, ku estimular le supervivencia tumen le desplazamiento le fenotipo ti' le inactivación.
IPA ku modular u expresión le genes fibroblastos, apoptóticos, viabilidad yéetel dinámica mitocondrial ti' células LX-2. Le histogramas ku ye'esik u expresión le mRNA relativa ti' le kaambalil yo'osal endógeno (RPLP0 wa PPIA) ka' u células LX-2 bino'ob inducidas yéetel TGF-β1 yéetel IPA ti' chúumuk libre u suero ichil 24 h. A ku ye'esik fibroblastos, B ku ye'esik células apoptóticas, C ku ye'esik células kuxa'ano'ob, yéetel D ku ye'esik expresión genética dinámica mitocondrial. Le datos ku ye'esa'al bey promedio ± desviación estándar (DE), n = 3 experimentos independientes. Le comparaciones estadísticas u realizaron utilizando ANOVA unidireccional yéetel prueba post hoc u Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Tu láak', le cambios ti' le Buka'aj le célula (FSC-H) yéetel le complejidad citoplasmática (SSC-H) bino'ob evaluados tumen citometría flujo (yoochel 6A, B), yéetel le cambios ti' le morfología celular ka' u Ts'a'akal IPA bino'ob evaluados tumen microscopía electrónica u transmisión (TEM) yéetel microscopía contraste fase (Figura suplementaria 6A-B). Bix u pa'ta'al, le células ti' le múuch' tratado yéetel TGF-β1 aumentó ti' Buka'aj ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal (yoochel 6A, B), ye'esik le expansión clásica ti' le retículo endoplásmico áspero (ER *) yéetel fagolisosomas (P), indicando activación células na' hematopoyéticas (HSC) (yoochel suplementaria 6A). Ba'ale', ti' comparación yéetel le múuch' tratado yéetel TGF-β1, le Buka'aj le célula, complejidad citoplasmática (Fig. 6A, B), yéetel contenido ER * disminuyeron ti' le múuch' Ts'a'akal combinación TGF-β1 yéetel IPA (Fig. 6A suplementaria). Beyxan, le Ts'a'akal IPA disminuyó le Buka'aj le célula, le complejidad citoplasmática (Figs. 6A, B), P yéetel ER * contenido (Fig. 6A suplementaria) ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal. Beyxan, u ya'abil le células apoptóticas aumentó ka' 24 h u Ts'a'akal IPA ti' comparación yéetel le múuch' kaambalil yo'osal (flechas sak wíiniko'obo', Fig. 6B suplementaria). Tu láakal, le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob sugieren u 1 mM IPA je'el u páajtal u estimular le apoptosis HSC yéetel revertir le cambios ti' le parámetros morfológicos celulares inducidos tumen TGF-β1, regulando bey le Buka'aj le célula yéetel le complejidad, ku páajtal asociar yéetel le inactivación HSC.
IPA ku k'exik u nojchil le célula yéetel u complejidad le citoplasma ti' le células LX-2. Máak representativas ti' le análisis citometría flujo. Le análisis utilizado jump'éel estrategia gating específica utia'al u células LX-2: SSC-A leti' FSC-A utia'al u definir le jo'olkaajo' celular, FSC-H leti' FSC-A utia'al u identificar dobles, yéetel SSC-H leti' FSC-H utia'al u análisis Buka'aj celular yéetel complejidad. Le células bino'ob incubadas yéetel TGF-β1 (5 ng leti' ml) yéetel 1 mM IPA ti' chúumuk libre u suero ichil 24 h. Le células LX-2 bino'ob distribuidas ti' cuadrante inferior izquierdo (SSC-H- leti' FSC-H-), cuadrante superior izquierdo (SSC-H + leti' FSC-H-), cuadrante inferior k'abil beya' (SSC-H- leti' FSC-H +), yéetel cuadrante superior k'abil beya' (SSC-H + leti' FSC-H +) utia'al u Buka'aj le célula yéetel análisis complejidad citoplásmica. B. Le morfología celular bin u analizada tumen citometría flujo utilizando FSC-H (dispersión tak táanil, Buka'aj celular) yéetel SSC-H (dispersión lateral, complejidad citoplasmática) (30.000 k'inbesajo'ob). Le datos ku ye'esa'al bey promedio ± SD, n = 3 experimentos independientes. Le comparaciones estadísticas u realizaron utilizando ANOVA unidireccional yéetel prueba post hoc u Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 yéetel ****p < 0.0001
Le metabolitos intestinales bey IPA ku séen convertido ti' jump'éel chokoj chun tuukulo' investigación, sugiriendo u túumben objetivos páajtal u descubiertos ti' le microbiota intestinal. Le o'olale' jach ts'áik u IPA, jump'éel metabolito k vinculado yéetel le fibrosis hepática ti' seres humanos [15], u demostrado u jump'éel compuesto antifibrótico potencial ti' modelos ba'alche'ob [13, 14]. Te'ela', k demostramos tumen yáax ka'atéen jump'éel asociación ichil IPA sérico yéetel transcriptómica hepática global yéetel metilación ADN ti' individuos obesos xma' diabetes bin yano'ob 2 (T2D), destacando le apoptosis, mitofagia yéetel longevidad, bey jump'éel posible gen candidato AKT1 regulando le homeostasis hepática. Uláak' ba'al túumben ti' k xook jach u demostramos le interacción le Ts'a'akal IPA yéetel le apoptosis, morfología celular, bioenergética mitocondrial yéetel dinámica ti' células LX-2, indicando jump'éel espectro energía asab t'okik ku desplaza le fenotipo HSC ti' le inactivación, beetik u IPA jump'éel candidato potencial utia'al u ma'alo'obkíinsiko'ob u fibrosis hepática.
K encontramos u le apoptosis, le mitofagia yéetel le longevidad bino'ob le vías canónicas asab importantes enriquecidas ti' le genes hepáticos asociados yéetel le IPA sérico circulante. U k'astal le yaan kanik calidad mitocondrial (MQC) je'el conducir ti' le disfunción mitocondrial, mitofagia yéetel apoptosis, promoviendo bey u aparición le MASLD [33, 34]. Le o'olale', je'el u páajtal k especular u IPA je'el u páajtal u táakpajal ti' le mantenimiento dinámica celular yéetel integridad mitocondrial yo'osal le apoptosis, mitofagia yéetel longevidad ti' le táaman. K datos mostraron u ka'ap'éel genes bino'ob náats'al ichil le óoxp'éel ensayos: YKT6 yéetel AKT1. K'a'ana'an u ya'ala'ale' YKT6 leti' jump'éel proteína SNARE ku táakpajal ti' le tuukula' fusión membrana celular. Ku báaxal jump'éel ju'un ti' le autofagia yéetel le mitofagia formando jump'éel complejo iniciación yéetel STX17 yéetel SNAP29 ti' le autofagosoma, promoviendo bey le fusión autofagosomas yéetel lisosomas [35]. Beyxan, u sa'atal u meyaj YKT6 ku ts'áaik tumen resultado le mitofagia deteriorada [36], ka' jo'op' u u regulación u YKT6 u asocia yéetel le progresión le carcinoma hepatocelular (HCC), ye'esik aumento ti' le supervivencia celular [37]. Ba'axten otra parte, AKT1 leti' le gen interactuante asab k'a'anan yéetel desempeña jump'éel ju'un Páaybe'en ti' le k'aas k'oja'anilo'obo' hepáticas, incluyendo PI3K leti' AKT bejil señalización, ciclo celular, migración celular, proliferación, adherencia focal, función mitocondrial, yéetel secreción colágeno [38-40]. Le bejo' señalización PI3K leti' AKT activado je'el u páajtal u activar le células na' hematopoyéticas (HSCs), ku le células responsables ti' le producción matriz extracelular (ECM), ka u disregulación je'el contribuir ti' le ocurrencia yéetel le progresión le fibrosis hepática [40]. Beyxan, AKT jach juntúul le factores clave u supervivencia le células ku inhibe le apoptosis celular dependiente u p53, ka activación AKT je'el u páajtal u asociada yéetel le inhibición le apoptosis células hepáticas [41, 42]. Le ba'ax ku yila'al ku ye'esik u IPA je'el u páajtal u táakpajal ti' le apoptosis asociada yéetel le mitocondrias hepáticas tumen afectar le k'alt'aan le hepatocitos ichil wokol ichil le apoptosis wa supervivencia. Le k'iino'oba' táanil páajtal u regulados tumen AKT yéetel leti' wa YKT6 genes candidatos, ku críticos utia'al u homeostasis hepática.
K ya'ala'al máaxo'ob máano'ob mostraron u 1 mM IPA indujo apoptosis yéetel disminuyó le respiración mitocondrial ti' células LX-2 independientes ti' le Ts'a'akal TGF-β1. K'a'ana'an u ya'ala'ale' le apoptosis jach jump'éel noj bejo' bejil utia'al u resolución le fibrosis yéetel le activación células na' hematopoyéticas (HSC), ka xan jach jump'éel k'inbesajo' clave ti' le núukik fisiológica reversible ti' le fibrosis hepática [4, 43]. Beyxan, u yutskíinta'al BHI ti' células LX-2 ka' u Ts'a'akal combinación tu ts'áaj túumben tuukulil yóok'ol le ju'uno' potencial ti' IPA ti' le regulación bioenergética mitocondrial. Yáanal condiciones descanso yéetel inactivas, le células hematopoyéticas normalmente utilizan fosforilación oxidativa mitocondrial utia'al u producir ATP yéetel yaantal baja actividad metabólica. Ba'axten otra parte, le activación HSC mejora le respiración mitocondrial yéetel le biosíntesis utia'al u compensar le demandas energía u yokol ti' le noj glucolítico [44]. U jaajile' ti' u IPA ma' afectó le potencial metabólico yéetel ECAR sugiere u le bejo' glucolítico jach menos priorizado. Bey xan, uláak' xook tu ye'esaj u 1 mM IPA bin capaz u modular le actividad tsolokbal respiratoria mitocondrial ti' cardiomiocitos, internet ichil celular u hepatocitos humanos (Huh7) yéetel células endoteliales u vena umbilical humana (HUVEC); Ba'ale', ma' bin encontrado mix efecto IPA ti' le glucólisis ti' le cardiomiocitos, sugiriendo u IPA je'el u páajtal u afectar le bioenergética uláak' tipos celulares [45]. Le o'olale', especulamos u 1 mM IPA je'el u páajtal u actuar bey juntúul desacoplador químico O'olkij, ts'o'ok u je'el xu'ulsiko'ob significativamente le expresión genética fibrogénica, morfología celular yéetel bioenergética mitocondrial xma' k'ex le cantidad mtDNA [46]. Le desacopladores mitocondriales páajtal inhibir le fibrosis inducida tumen le miatsil yéetel le activación HSC [47] yéetel xu'ulsiko'ob le producción ATP mitocondrial regulada wa inducida tumen ciertas proteínas bey proteínas desacoplamiento (UCP) wa translocasa nucleótido adenina (ANT). Je'el bix u bin yano'ob célula, le ba'ala' je'el u páajtal u wáaj le células ti' le apoptosis yéetel leti' wa promover le apoptosis [46]. Ba'ale', k'a'abéet u beeta'al uláak' xook uti'al u tsoolil u meyaj le IPA bey jump'éel desacoplador mitocondrial ti' le inactivación células na' hematopoyéticas.
Tu láak' investigamos wa le cambios ti' le respiración mitocondrial ku reflejan ti' le morfología mitocondrial ti' le células LX-2 kuxa'an. Jach jats'uts, le Ts'a'akal TGF-β1 altera le proporción mitocondrial u esférica u intermedia, yéetel disminución le ramificación mitocondrial yéetel aumento le expresión DRP1, jump'éel factor clave ti' le fisión mitocondrial [48]. Beyxan, le fragmentación mitocondrial ku nupikubáa yéetel u complejidad le páawo'ob tuláakal, yéetel le transición ti' le fusión ti' le fisión jach crítica utia'al u activación le células na' hematopoyéticas (HSC), mientras u inhibición le fisión mitocondrial conduce ti' le apoptosis HSC [49]. Beyo', k ya'ala'al máaxo'ob máano'ob indican u Ts'a'akal TGF-β1 je'el inducir jump'éel disminución ti' le complejidad páawo'ob mitocondrial yéetel disminución le ramificación, ba'ax le asab común ti' le fisión mitocondrial asociada yéetel células na' hematopoyéticas activadas (HSCs). Beyxan, k datos mostraron u IPA je'el k'ex le proporción mitocondrias u beyo' esférica u beyo' intermedia, reduciendo bey u expresión OPA1 yéetel MFN2. Xook ts'o'ok u demostrado u downregulation u OPA1 je'el u páajtal u causar jump'éel disminución ti' le potencial membrana mitocondrial yéetel desencadenar le apoptosis celular [50]. MFN2 leti'e' k'ajóolta'an tumen mediar le fusión mitocondrial yéetel le apoptosis[51]. Le ba'ax ku yila'al ku ye'esik u inducción le células LX-2 tumen TGF-β1 yéetel leti' wa IPA ku chíikpajal utia'al u modular beyo' yéetel Buka'aj mitocondrial, bey noj activación yéetel complejidad páawo'ob.
K ya'ala'al máaxo'ob máano'ob indican u le Ts'a'akal combinación TGFβ-1 yéetel IPA je'el u páajtal u xu'ulsiko'ob mtDNA yéetel parámetros morfológicos celulares yo'osal u regulación le expresión mRNA ti' le fibrosis, apoptosis yéetel genes relacionados yéetel le supervivencia ti' células ku evaden le apoptosis. Jach jaajile', IPA tu t'okik u nivelil expresión mRNA ti' AKT1 yéetel genes fibrosis importantes bey COL1A2 yéetel MMP2, ba'ale' tu ya'abtal u nivelil expresión CASP8, ba'ax ku nupikubáa yéetel le apoptosis. K ya'ala'al máaxo'ob máano'ob mostraron u ka' u Ts'a'akal IPA, le expresión BAX disminuyó yéetel le expresión mRNA ti' le subunidades familiares TIMP1, BCL-2 yéetel NF-κB aumentó, sugiriendo u IPA je'el u páajtal u estimular señales supervivencia ti' células na' hematopoyéticas (HSCs) ku evadan le apoptosis. Le k'iino'oba' moléculas páajtal actuar bey señales pro-supervivencia ti' células na' hematopoyéticas activadas, ku páajtal asociar yéetel aumento ti' le expresión proteínas antiapoptóticas (bey Bcl-2), disminución ti' le expresión BAX pro-apoptótica, yéetel juntúul interacción compleja ichil TIMP yéetel NF-κB [5, 7]. IPA ku beetik u meyaj yo'osal PXR, ka k encontramos u Ts'a'akal combinación yéetel TGF-β1 yéetel IPA aumentó le niveles expresión mRNA PXR, indicando supresión le activación HSC. Le señalización PXR activada leti'e' k'ajóolta'an tumen inhibir le activación HSC tanto in vivo bey in vitro [52, 53]. K ya'ala'al máaxo'ob máano'ob indican u IPA je'el táakpajal ti' le limpieza HSCs activados yo'osal u promoción le apoptosis, reducción le fibrosis yéetel le metabolismo mitocondrial, ka ma'alo'obkíinsiko'ob le señales supervivencia, ku procesos típicos ku sutk'esiko'ob le fenotipo HSC activado ti' jump'éel inactivado. Uláak' tsoolil je'el u páajtal u beetik le mecanismo potencial yéetel le ju'uno' IPA ti' le apoptosis jach u scavenges mitocondrias disfuncionales chuunil laat'a'an yo'osal le mitofagia (bejil intrínseca) yéetel le beejil señalización TNF extrínseca (tabla 1), ku táan Jun vinculada ti' le beejil señalización supervivencia NF-κB (Suplementario Figura 7). Jach jats'uts, le genes enriquecidos relacionados yéetel IPA táan u béeytal u inducir señales pro-apoptóticas yéetel pro-supervivencia ti' le bejo' apoptótico [54], sugiriendo u IPA je'el inducir le bejo' apoptótico wa supervivencia interactuando yéetel le k'iino'oba' genes. Ba'ale', bix IPA induce apoptosis wa supervivencia ichil le activación HSC yéetel u vías mecanísticas permanecen ma' claras.
IPA jump'éel metabolito microbiano ku beeta'al yéetel le triptófano dietético yo'osal le microbiota intestinal. Xook ts'o'ok u ye'esik yaan ti' propiedades reguladoras antiinflamatorias, antioxidantes yéetel epigenéticas ti' le entorno intestinal.[55] Xook ts'o'ok u demostrado u IPA je'el u páajtal u modular le función barrera intestinal yéetel xu'ulsiko'ob le estrés oxidativo, ku páajtal contribuir ti' u táanil fisiológicos locales.[56] U jaajile', IPA ku bisik ti' le órganos objetivo yo'osal le circulación, ka ts'o'ok u IPA comparte jump'éel ba'ax metabolito noj bejo' similar yéetel triptófano, serotonina, yéetel derivados indol, IPA ejerce acciones metabólicas resultando ti' destinos metabólicos competitivos.[52] IPA je'el u páajtal u competir yéetel metabolitos derivados ti' triptófano utia'al u kúuchilo'ob unión ti' enzimas wa receptores, potencialmente interrumpiendo le vías metabólicas normales. Le je'ela' ku ye'esik u k'a'abéettal u beeta'al uláak' xook yóok'ol u farmacocinética yéetel farmacodinámica uti'al u ma'alob na'ata'al u ventana terapéutica.[57] P'áatal u yila'al wa le je'ela' je'el u páajtal u yúuchul xan ti' le células na' hematopoyéticas (HSCs).
k ojéeltik yaan k xook yaan ba'ax ku xu'ulul. Utia'al u xak'altik específicamente le asociaciones relacionadas yéetel IPA, excluimos k'oja'ano'ob yéetel diabetes mellitus bin yano'ob 2 (T2DM). K k'ajóoltik le je'ela' ku jets'ik u amplia aplicabilidad k hallazgos ti' le k'oja'ano'ob yéetel diabetes mellitus bin yano'ob 2 yéetel k'oja'anil hepática avanzada. Kex le concentración fisiológica ti' IPA ti' suero humano jach 1-10 μM [11, 20], jump'éel concentración 1 mM IPA bin elegida basada ti' le asab concentración ma' tóxica [15] yéetel le asab tasa apoptosis, yéetel mix jela'anil in ti' le porcentaje le jo'olkaajo' células necróticas. Kex ti' le xooko' meyajnaj niveles suprafisiológicos ti' IPA, bejla'e' mina'an mix jump'éel éejenil yo'osal le dosis xoknáalo'obo' ti' IPA [52]. Kex k ya'ala'al máaxo'ob máano'ob ku significativos, le destino metabólico asab amplio ti' IPA sigue siendo jump'éel yo'osal activa ti' le investigación. Beyxan, k kaxtik yóok'ol le asociación ichil le niveles IPA séricos yéetel le metilación ADN ti' le transcripciones hepáticas bino'ob obtenidas ma' chéen ti' células na' hematopoyéticas (HSCs) sino xan ti' le tejidos hepáticos. Elegimos utilizar células LX-2 humanas basadas ti' k hallazgos anteriores ti' le análisis transcriptoma u IPA u asocia yéetel le activación células na' hematopoyéticas (HSC) [15], ka HSCs le le k'ajle' células involucradas ti' le progresión le fibrosis hepática. Le táaman ku beeta'al yéetel ya'abkach tipos células, bey u uláak' modelos células bey t.u.m co-cultivo células hepatocitos-HSC-inmune combinado yéetel activación caspasa yéetel fragmentación ADN bey le mecanismo meyajo'ob incluyendo nivel proteína k'a'ana'an u considerado utia'al u xook le ju'uno' IPA yéetel u interacción yéetel uláak' tipos células hepáticas.