Le clasificación proteínas ti' le bejo' secretora jach tuukulo'obo' utia'al u mantener le compartimentación celular yéetel le homeostasis. Beyxan ti' kaambalilo'ob le clasificación mediada tumen cáscara, le ju'uno' le lípidos ti' le clasificación kinesina ti' le tuukula' transporte secretorio jach jump'éel k'áat chi' básico chowak plazo ba'ax láayli' ma' u sido núuka'al. Te'ela', k meentik 3D simultáneo multicolor ka'anal resolución tu k'iinil xíimbal tumen utia'al u probar in vivo u proteínas glucosilfosfatidilinositol-inmovilizadas recién sintetizadas yéetel restos lípidos ceramida jach chowaktako'ob ku agrupan yéetel clasifican ti' endoplasmas especializados ts'ono'oto' salida neta, ba'ax le jela'an u le proteínas transmembrana utilizadas. Beyxan, k e'esik u chowakil u tsolokbal le ceramida ti' le membrana retículo endoplásmico jach crítico utia'al u selectividad u clasificación. K xook proporciona le yáax prueba directa in vivo utia'al u clasificar kuuch proteínas basadas ti' le longitud tsolokbal lipídica ti' kúuchilo'ob jo'osa'al bisbil ba'alche'obo' selectiva ti' le bejo' secretoría.
Ti' le células eucariotas, le proteínas sintetizadas ti' le retículo endoplásmico (ER) ku ts'o'okole' ku clasifican ichil le transporte yo'osal le bejo' secretoría utia'al u k'u'ubul ti' u destino celular apropiado (1). Beyxan ti' kaambalilo'ob le clasificación mediada tumen le capa, u chowak especulado u ciertos lípidos xan páajtal meyaj bey ti'its salida selectiva agrupando le ti' dominios membrana específicos u proteínas específicas (2-5). Ba'ale', láayli' yaan jump'éel si'ipil pruebas in vivo directas utia'al u probar le posible mecanismo basado ti' lípidos. Utia'al u resolver le talamilo' básico, estudiamos ti' le levadura bix u glucosilfosfatidilinositol (GPI) proteínas ancladas (GPI-APs) ku exportan diferencialmente ti' le ER. GPI-APs le jump'éel variedad proteínas superficie celular conectadas ti' lípidos ( 6, 7). GPI-AP leti' jump'éel proteína secretada ku une ti' le folletos exteriores ti' le membrana plasmática yo'osal le resto glucolípido (ancla GPI). Ku k'amik anclas GPI bey modificaciones post-translacionales conservadoras ti' le lúmen ER (8). Ka' ts'o'ok u ts'áabal, GPI-AP ku máan tumen le aparato Golgi (5, 9) tak le ER tak le membrana plasmática. U yaantal anclas GPI ku beetik u GPI-AP u transportado tumen separado u proteínas secretadas transmembrana (incluyendo uláak' proteínas membrana plasmática) a lo largo de le bejo' secretoría (5, 9, 10). Ti' le células levadura, GPI-APs ku separan ti' uláak' proteínas secretadas ti' le retículo endoplásmico, ka tu láak' embalados ti' vesículas únicas envueltas tumen complejo proteína capa II (COPII) (6, 7). Le determinantes ti' le tuukula' clasificación ti' le tuukula' jo'osa'al bisbil ba'alche'obo' u ER ma' le claros, ba'ale' ku especula u le mecanismo je'el u páajtal u requerir lípidos, especialmente le remodelación estructural ti' le porción lipídica ti' le ancla GPI (5, 8). Ti' le levadura, le remodelación lípidos GPI Káaj inmediatamente ka' le GPI ku une, ka tu ya'ab k'oja'ano'ob, ku beetik u ceramida u unir u ti' le ácido graso saturado u tsolokbal chowak 26 carbono (C26:0) (11, 12). le ceramida C26 leti' le ceramida noj bejo' ku beetik u células levadura tak bejla'e'. ku sintetizar ti' le ER yéetel óol tuláakal le máasewáalo'obo' leti'obe' ku exporta ti' le aparato Golgi yo'osal vesículas COPII (13). Le jo'osa'al bisbil ba'alche'obo' u ER u GPI-AP k'a'abet específicamente síntesis ceramida continua (14, 15), ka tu sucesivamente, u yokol k'ujo'ob ti' ceramida ti' inositol fosfato ceramida (IPC) ti' le aparato Golgi yaantal yo'osal u síntesis anclaje GPI (16). Xook biofísicos yéetel membranas artificiales ts'o'ok u demostrado u ceramidas u tsolokbal acil jach chowak páajtal coalescer utia'al u formar dominios ordenados yéetel propiedades físicas únicas (17, 18). Le k'iino'oba' datos conducen ti' le hipótesis u C26 ceramida yéetel GPI-AP yéetel C26 ceramida utilizan u propiedades físicas utia'al u coalescer ti' regiones ordenadas wa regiones ti' le entorno lípido membrana ER relativamente desordenado. Ku beeta'al chuunil laat'a'an yéetel glicerolípidos Kóomtak yéetel ma' saturados (C16:1 yéetel C18:1) (19, 20). Le k'iino'oba' regiones ku centrarán selectivamente ti' kúuchilo'ob salida ER específicos (ERES), tu'ux ceramida yéetel ceramida basado ti' GPI-AP páajtal u co-transportados ti' le Golgi ti' le bak'paach vesícula COPII dedicada (5).
Te' xook je'ela', ts'o'ok k probado Jun le mecanismo basado ti' lípidos yo'osal u búukinta'al microscopía u imagen confocal tu k'iinil xíimbal tumen u superresolución (SCLIM), ba'ax le jump'éel láaka microscopía vanguardista u páajtal u observar simultáneamente proteínas etiquetadas fluorescentemente Le máak óoxp'éel boonilo'ob yéetel tridimensionales (3D) yaan ti' extremadamente ka'anal resolución yéetel velocidad ti' células kuxa'an (22, 22).
Yáax aplicamos le ma'alo'obtal SCLIM utia'al u definir asab bix u GPI-AP normal yéetel múuch' ceramida C26 bin u cribado u proteínas secretadas transmembrana ka' jóok'ol le ER ti' S. cerevisiae. Utia'al u yila'al u clasificación le ER, utilizamos jump'éel t.u.m genético u páajtal u Jun visualizar kuuch recién sintetizado ku yokol ERES in vivo (7, 23). Bey kuuch, elegimos C26 ceramida basado ti' GPI-AP Gas1 etiquetado yéetel proteína fluorescente ya'ax (GFP) yéetel proteína secretada transmembrana Mid2 etiquetada yéetel proteína fluorescente infrarroja cercana (iRFP), ambas ku dirigen ti' le membrana plasmática (24-26). Ti' le mutante sensible ti' le temperatura sec31-1, le ka'ap'éel kuuch ku expresan yáanal jump'éel promotor inducible tumen galactosa yéetel juntúul marcador ERES constitutivo. Ti' le temperatura extrema (37°C), tuméen le mutación sec31-1 afecta le función le componente capa COPII Sec31 utia'al u inhibir le germinación COPII yéetel le jo'osa'al bisbil ba'alche'obo' u ER, kuuch recién sintetizado ku acumula ti' le ER (23). Ka' ts'o'ok u síistal tak jump'éel temperatura baja (24°C), le células mutantes sec31-1 recuperaron ti' le yo'osal secretora, yéetel le túumben kuuch sintético acumulado Káaj u exportar u ti' le ER. U yila'al CLIM tu ye'esaj u óol tuláakal le máasewáalo'obo' ti' le recién sintetizados Gas1-GFP yéetel Mid2-iRFP láayli' acumularon ti' le ER ti' le células mutantes sec31-1 ka' incubación ti' 37 ° c ka tu láak' liberado ti' 24 ° c ichil 5 minutos (yoochel 1). Tuméen Mid2-iRFP ku t'o'oxol ti' tuláakal le membrana ER, yéetel Gas1-GFP ku concentra yéetel ku múuch'ik ti' le yo'osal u membrana ER discontinua, u distribución jach jaatsatako'ob jela'an (yoochel 1, A u C yéetel cha'ano' S1). Beyxan, je'el bix u ye'esik ti' le yoochel 1D, le múuch' Gas1-GFP mina'an ti' Mid2-iRFP. Le ba'ax ku yila'ala' ku ye'esik u GPI-AP yéetel le proteínas transmembrana bino'ob separadas ti' jejeláas regiones membrana ER temprano. Le múuch' Gas1-GFP táan adyacente ti' jump'éel ERES específico etiquetado yéetel proteína capa COPII mCherry Sec13 (yoochel 1, E yéetel F, yéetel cha'ano' S1) (23).
le células sec31-1 expresan secreciones inducidas tumen le galactosa, jump'éel chowak tsolokbal acil (C26) ceramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ya'ax) yéetel le proteína transmembrana Mid2-iRFP (TMP, azul) yéetel le ba'ala' etiquetado ERES constructivo Sec13-mCherry (E) bin incubado ti' 30°C minutos, péeksa'ab ti' 24°C, ka tu ch'a'aj u yoochel tumen SCLIM 5 minutos chúunk'in. (A u C) ye'esik jump'éel representante fusionado wa chéen wíimbala' 2D ti' jump'éel plano (A), jump'éel wíimbala' proyección 2D ti' 10 z-secciones (B) wa jump'éel wíimbala' hemisferio celular 3D ti' kuuch yéetel marcadores ERES (C). Barra de escala 1μm (A yéetel B). Le unidad escala jach 0.551μm (C). Gas1-GFP bin detectado ti' regiones discretas ER wa racimos, ka' jo'op' u Mid2-iRFP bin detectado yéetel distribuido ti' tuláakal le membrana ER (C). (D) Le gráfico ku ye'esik u intensidad le fluorescencia relativa ti' Gas1-GFP yéetel Mid2-iRFP ti' le múuch' Gas1-GFP a lo largo de le internet ichil flecha sak (ts'íik lela'). AU, unidad arbitraria. (E yéetel F) ku chíikbesiko'ob le wíimbala' 3D ku nupikubáa le mercancías yéetel le marca ERES. Gas1-GFP clusters bino'ob detectados naats' le ERES específico. Le unidad escala jach 0.551μm. (F) Le sak flecha sólida marca le múuch' Gas1-GFP asociado yéetel ERES. Le paneles chúumuk yéetel k'abil beya' ku ye'esik le wíimbala' 3D ampliada fusionada yéetel jump'éel visión girada ti' le clúster Gas1-GFP seleccionado.
Le estrecha relación espacial ichil le múuch' Gas1-GFP yéetel juntúul ERES específico indica u Gas1-GFP je'el wokol ichil ERES selectivo, ba'ax le jela'an u le selectividad utilizada tumen Mid2-iRFP utia'al u p'atik le ER. Utia'al u yila'al le je'ela', k cuantificamos le relación ERES utia'al chéen jump'éel wa ka'ap'éel mercancías (yoochel 2, A u C). K encontramos u óol tuláakal le máasewáalo'obo' u ERES (70%) ku taasik chéen jump'éel bin yano'ob kuuch. Le wíimbala' inferior ti' le yoochel 2C ye'esik ka'ap'éel ejemplos típicos u ERES yéetel chéen Gas1-GFP (yoochel 1) wa chéen Mid2-iRFP (yoochel 2). U jela'anil, yan 20% ti' le ERES ku taasik ka'ap'éel kuuch ku superponen ti' le bak'paach kúuchil. Kaxta'ab yaan ERES (10%) yaan ka'ap'éel u jejeláasil kuuch, ba'ale' bino'ob aislados ti' jejeláas kúuchilo'ob. Le o'olale', le análisis estadístico ku ye'esik u ka' u jo'osa'al le ER, GPI-AP Gas1-GFP yéetel le kuuch transmembrana Mid2-iRFP ku jats ti' jejeláas ERES (yoochel 2D). Le eficiencia clasificación jach consistente yéetel le análisis bioquímico anterior (6) yéetel determinación morfológica (7). Xan je'el u páajtal k observar le comportamiento le kuuch cuarentena ku yokol ERES (Figura 2E yéetel cha'ano' S2). Le yoochel 2E ku ye'esik chéen jump'éel chan jaats Gas1-GFP (panel 3) wa Mid2-iRFP (panel 4) ku yokol ti' le ERES tak jump'éel tséel yéetel táan confinado ti' jump'éel yo'osal discreta. Le panel 5 ti' le yoochel 2E ku ye'esik u Gas1-GFP yéetel Mid2-iRFP Yaan k'iine' ku lu'umo'oba' ti' le k'iino' je'el xano' ERES, ba'ale' ku yokol tak jejeláas lados yéetel ku concentran ti' regiones separadas u páajtal u representar jejeláas vesículas COPII. Xan confirmamos u le separación observada yéetel le clasificación GPI-AP Gas1 basado ti' ceramida C26 bey ERES selectivo jach específico tuméen uláak' kuuch secreción transmembrana, le proteína membrana plasmática etiquetada tumen GFP Axl2 (27 ), ye'esik comportamiento similar ti' Mid2-iRFP. (Oochelo' S1 yéetel cha'ano' S3). Le túumben sintetizado Axl2-GFP ku distribuye tumen le membrana ER bey Mid2-iRFP (yoochel S1, jump'éel yéetel B), ka u co-localiza yéetel Mid2-iRFP ti' óol tuláakal le máasewáalo'obo' u ERES (yoochel S1, B u D). Le panel 1 yéetel 2 ti' le yoochel 1. S1C ye'esik ka'ap'éel ejemplos típicos ti' ERES tu'ux ku superponen ka'ap'éel kuuch transmembrana. Ti' le k'iino'oba', ambas mercancías ku yokol ERES múuch' (Figura S1E, Panel 3 yéetel cha'ano' S3).
Le células sec31-1 ku expresan secreciones inducibles tumen galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, ya'ax) yéetel Mid2-iRFP (TMP, azul) yéetel etiquetado ERES constitutivo Sec13-mCherry (ERES, magenta) bino'ob colocados ti' 37 Ka' incubación ichil 30 minutos ti' ° C, utia'al u péeksik le wíimbala' secreto yéetel bloqueo yéetel SCLIM ka' 20 minutos. (A tak C) máak u proyección 2D representativas (A; barra u escala, 1μm) wa máak u hemisferio celular 3D (B yéetel C; unidad u escala, 0.456μm) ti' le kuuch yéetel 10 z-secciones marcadas tumen ERES. Le panel inferior ti' (B) yéetel le panel ti' (C) ye'esik máak procesadas utia'al u we'esik chéen le mercancías presentes ti' ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) yéetel Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Flecha abierta: ERES chéen ku bisik jump'éel xéet' kuuch (1 u 4). Flecha gris: ERES ku taasik kuuch segregada (5). Flecha sólida sak: ERES ku taasik kuuch co-localizado. Tu yáanal: Le ERES chen yéeya'ano' chéen yaan ti' Gas1-GFP (1) wa Mid2-iRFP (2). Barra de escala, 100 nm. (D) Cuantificación ti' le fotomicrografía descrita ti' (C). Le porcentaje chúumuk ERES ku taasik chéen jump'éel kuuch (Gas1-GFP wa Mid2-iRFP), kuuch segregado yéetel kuuch superpuesto. Ti' óoxp'éel experimentos independientes, n=432 ti' 54 células. Barra de error = SD. Prueba t ma' emparejada u ka'ap'éel colas. *** P = 0.0002. (E) 3D wíimbala' u ERES seleccionado u kuuch cuarentena marcado yéetel (C). Gas1-GFP (ya'ax) (3) wa Mid2-iRFP (azul) (4) ku yokol ERES (magenta) ti' jump'éel tséel yéetel ku p'áatal ti' jump'éel chan kúuchil ichil ERES. Yaan k'iine', ka'ap'éel tipos kuuch ku yokol ti' le k'iino' je'el xano' ERES (5) tak le k'iino' je'el xano' tséel yéetel ku confinados ti' jump'éel kúuchil aislado ichil le ERES. Barra de escala, 100 nm.
Tu láak', probamos jump'éel hipótesis u le ceramida tsolokbal acil chowak (C26) presente ti' le membrana ER impulsa le agrupación específica yéetel clasificación Gas1 ti' ERES selectivo. Utia'al u beyo', utilizamos jump'éel cepa levadura modificada GhLag1, tu'ux le ka'ap'éel sintasas ceramida endógenas Lag1 yéetel Lac1 bino'ob reemplazadas tumen GhLag1 (le homólogo Lag1 ti' piits'), ts'áaik tumen resultado jump'éel cepa levadura yéetel juntúul cepa ceramida membrana celular asab kóom u bin yano'ob salvaje (Figura 3A) (28). Le análisis espectrometría de masas (MS) tu ye'esaj ti' le cepas bin yano'ob salvaje, 95% ti' le ceramida total jach chowak (C26) ceramida tsolokbal, ka' jo'op' u ti' GhLag1, 85% ti' le ceramida jach chowak (C18 yéetel C16). ), chéen 2% ti' le ceramida jach chowak (C26) tsolokbal ceramida. Kex C18 yéetel C16 ceramidas le le k'ajle' ceramidas detectadas ti' le membrana GhLag1 tak bejla'e', análisis MS xan confirmó u le ancla GPI u Gas1-GFP expresado ti' le cepa GhLag1 ku taasik ceramida C26, ba'ax le comparable yéetel lípidos bin yano'ob salvaje. Le calidad jach le k'iino' je'el xano' (Fig. 3A) (26). Le o'olale', le je'ela' u k'áat u ya'al ti' le enzima remodelación ceramida Cwh43 jach jach selectiva utia'al u ceramida C26, bey ku ye'esik ti' le yoochel 26, incorpora preferentemente le ancla GPI ti' jump'éel chan cantidad ceramida C26 ti' le cepa GhLag1. S2 (29). Kex beyo', le membrana celular ti' GhLag1 básicamente chéen ku taasik ceramida C18-C16, ka' jo'op' u Gas1-GFP láayli' yaan ti' ceramida C26. Le je'ela' ku beetik u le cepa jump'éel nu'ukula' ideal utia'al u resolver específicamente le talamilo' le longitud tsolokbal acil ti' le ceramida membrana ti' le ER. Le ju'uno' hipotético ti' le xook yéetel le clasificación. Tu láak', yáax estudiamos le Buka'aj u ba'al u C26 Gas1-GFP utia'al u acumular ti' racimos ti' GhLag1 yéetel juntúul alelo mutante sensible ti' le temperatura u sec31-1 yo'osal le microscopía fluorescencia convencional, tu'ux chéen le tsolokbal chowak (C18-C16) yaan ti' le membrana ER Ceramide (Fig. 3). K ilik u ti' sec31-1, óol tuláakal le máasewáalo'obo' u Gas1-GFP u concentrado ti' racimos, ka' jo'op' u Gas1-GFP ti' sec31-1 GhLag1 yéetel chowak (C18-C16) chowak membrana ceramida ER bin chuunil laat'a'an ma' agrupado yéetel distribuido ti' In tuláakal le membrana ER. Utia'al u jach jaaj, tuméen le agrupación basada ti' ceramida C26 táan estrechamente relacionada yéetel ERES específico (yoochel 1), tu láak' investigamos wa le tuukula' je'el xan implicar le función le mecanismo proteína jo'osa'al bisbil ba'alche'obo' u ER. GPI-AP meyajtiko'ob jump'éel t.u.m COPII yaabilajech uti'al u jo'osa'al ER, ba'ax ku regula activamente tumen Ted1′s remodelación estructural ti' le porción glicano ti' le ancla GPI (30, 31). Le GPI-glycan recombinante ku k'ajóolta'al tumen le complejo receptor kuuch transmembrana p24, ku tu sucesivamente recluta selectivamente Lst1, ba'ax le jump'éel isoforma específica ti' le noj bejo' subunidad unión kuuch COPII Sec24, formando jump'éel GPI-AP-ayik'al COPII Vesículas ku k'a'abeto'ob (31-33). Le o'olale', k meentik jump'éel doble mutante ku combina le eliminación le k'iino'oba' proteínas simples (le componente complejo p24 Emp24, enzima remodelación GPI-glicano Ted1 yéetel le subunidad COPII específica Lst1) yéetel le cepa mutante sec31-1, ka tu estudiaron ¿Je'el u páajtal u formar Gas1-cluster GFP (Figura 3). K ilik ti' sec31-1emp24Δ yéetel sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP jach chuunil laat'a'an ma' agrupado yéetel distribuido ti' tuláakal le membrana ER, bey u yila'al ka'ache' ti' sec31-1 GhLag1, ka' jo'op' u ti' sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP bey sec31-1-11. Le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob indican u Beyxan ti' kaambalilo'ob u yaantal ceramida C26 ti' le membrana ER, le agrupación Gas1-GFP xan k'a'abet u unir u ti' le complejo p24, ka ma' k'a'abet reclutamiento Lst1 específico. Tu láak', exploramos u posibilidad u le longitud tsolokbal ceramida ti' le membrana ER je'el u páajtal u regular le unión Gas1-GFP u p24. Ba'ale', k encontramos u yaantal ceramida C18-C16 ti' le membrana ma' afecta le GPI-glucanos reconstruidos tumen le complejo p24 (Figuras S3 yéetel S4, jump'éel yéetel B) wa unión ti' GPI-AP yéetel jo'osa'al bisbil ba'alche'obo' u GPI-AP. áabilidad. Reclutar COPII subtipo Lst1 (Figura S4C). Le o'olale', le agrupación dependiente ti' le ceramida C26 ma' k'a'abet interacciones proteínas yéetel jejeláas mecanismos proteínas jo'osa'al bisbil ba'alche'obo' u ER, ba'ale' soporta jump'éel mecanismo u clasificación alternativa impulsado tumen le longitud lípidos. Tu láak', analizamos wa le longitud tsolokbal acil ceramida ti' le membrana ER Páaybe'en utia'al u clasificación xoknáalo'obo' u Gas1-GFP bey ERES selectivo. Tuméen Gas1 ti' le cepa GhLag1 yéetel ceramida u tsolokbal kóom p'atik le ER yéetel ku yokol ti' le membrana plasmática (yoochel S5), creemos u wa le clasificación jach impulsada tumen le longitud le tsolokbal acil ceramida, le Gas1 ti' le cepa GhLag1 je'el u páajtal u redirigido yéetel cruzado. mercancías ERES yéetel le bak'paach membrana.
(A) Le membrana celular u GhLag1 chuunil laat'a'an ku taasik ceramidas C18-C16 asab Kóomtak, ka' jo'op' u le ancla GPI u Gas1-GFP láayli' yaan ti' le k'iino' je'el xano' C26 IPC bey células bin yano'ob salvaje. Tu yóok'ol: análisis u longitud le tsolokbal acil ti' le ceramida ti' le membrana celular u bin yano'ob salvaje (Wt) yéetel cepas GhLag1p tumen espectrometría ti' juuch' (MS). Le datos ku chíikbesiko'ob u porcentaje le ceramida total. U chúumuk óoxp'éel experimentos independientes. Barra de error = SD. Prueba t ma' emparejada u ka'ap'éel colas. **** P ＜0.0001. Panel inferior: Análisis MS ti' le longitud tsolokbal acil ti' le IPC presente ti' le ancla GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) expresado ti' le cepas bin yano'ob salvaje yéetel GhLag1p. Le datos ku chíikbesiko'ob le porcentaje ti' le señal IPC total. U chúumukil jo'op'éel experimentos independientes. Barra de error = SD. Prueba t ma' emparejada u ka'ap'éel colas. ns, ma' k'a'anan. P = 0.9134. (B) Micrografías u fluorescencia u sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ yéetel sec31-1lst1Δ células expresando Gas1-GFP inducido tumen galactosa bino'ob incubadas ti' 37 ° C ichil 30 minutos yéetel máan rutina u fluorescencia microscopía ka' 24°C. Sak flecha: ER Gas1-GFP clúster. Flecha abierta: Gas1-GFP ma' agrupado ku distribuye ti' tuláakal le membrana ER, ye'esik le tinción ts'ipit k'ab nuclear característica ER. Barra de escala, 5μm. (C) Cuantificación ti' le fotomicrografía descrita ti' (B). Le porcentaje chúumuk u células yéetel ba'ax Gas1-GFP punteada. Ti' óoxp'éel experimentos independientes, n≥300 células. Barra de error = SD. Prueba t ma' emparejada u ka'ap'éel colas. **** P ＜0.0001.
Utia'al u yutskíinta'al le talamila', k meentik jump'éel visualización SCLIM ti' Gas1-GFP yéetel Mid2-iRFP ti' GhLag1 yéetel le alelo mutante sensible ti' le temperatura sec31-1 (yoochel 4 yéetel cha'ano' S4). Le ken u ER bin retenido ti' 37 ° C yéetel posteriormente liberado ti' 24 ° C, óol tuláakal le máasewáalo'obo' ti' le recién sintetizado Gas1-GFP ma' bin agrupado yéetel distribuido ti' tuláakal le membrana ER, bey observado tumen microscopios convencionales (Yo'osal 4, jump'éel yéetel B ). Beyxan, jump'éel nojoch porcentaje ERES (67%) ku táakbesik ka'ap'éel u jejeláasil kuuch co-localizado ti' leti' (Figura 4D). Le paneles 1 yéetel 2 ti' le yoochel 4C ku ye'esik ka'ap'éel ejemplos típicos ti' ERES yéetel superposición Gas1-GFP yéetel Mid2-GFP. Beyxan, ambas mercancías bino'ob reclutadas ti' le k'iino' je'el xano' ERES (yoochel 4E, panel 3 yéetel cha'ano' S4). Le o'olale', k ya'ala'al máaxo'ob máano'ob indican u le longitud le tsolokbal acil ceramida ti' le membrana ER jach jump'éel determinante Páaybe'en ti' le agregación yéetel clasificación proteínas ER.
Sec31-1 GhLag1 células ku expresan secreciones inducidas tumen galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, ya'ax) yéetel Mid2-iRFP (TMP, azul) yéetel constitutivo ERES-etiquetado Sec13-mCherry (ERES, magenta) Incuba ti' 37 ° C. t'u'uchpachtik ichil 30 minutos, lúubul tak 24°C uti'al u jóok'sik le secreciones, ka wíimbala' yéetel SCLIM ka' 20 minutos. (A tak C) Imágenes u proyección 2D representativas (A; barra u escala, 1μm) wa máak u hemisferio celular 3D (B yéetel C; unidad u escala, 0.45μm) ti' le 10 z-secciones marcadas tumen kuuch yéetel ERES. Le panel inferior ti' (B) yéetel le panel ti' (C) ye'esik máak procesadas utia'al u we'esik chéen le mercancías presentes ti' ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) yéetel Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Flecha Chuup yéetel sak: ERES, superposición u mercancías. Je'e flecha: ERES ku taasik chéen jump'éel ba'al. Panel inferior: Le ERES seleccionado yaan ti' mercancías superpuestas (1 yéetel 2) marcadas ti' (C). Barra de escala, 100 nm. (D) Cuantificación ti' le fotomicrografía descrita ti' (C). Ti' le kúuchilo'ob sec31-1 yéetel sec31-1 GhLag1, chéen jump'éel kuuch (Gas1-GFP wa Mid2-iRFP) táan incluido, yéetel le porcentaje promedio u ERES utia'al u kuuch aislado yéetel kuuch superpuesto. Ti' óoxp'éel experimentos independientes, n = 432 ti' 54 células (sec31-1) yéetel n = 430 ti' 47 células (sec31-1 GhLag1). Barra de error = SD. Prueba t ma' emparejada u ka'ap'éel colas. *** P = 0.0002 (sec31-1) yéetel ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) wíimbala' 3D ti' ERES seleccionado yéetel kuuch superpuesto (3) marcado ti' (C). Gas1-GFP (ya'ax) yéetel Mid2-iRFP (azul) ku náats'al ti' ERES (magenta) ti' le k'iino' je'el xano' tséel yéetel ku p'áatal ti' le k'iino' je'el xano' kúuchil restringido ERES. Barra de escala, 100 nm.
Le xooko' ku ts'aik jump'éel prueba directa in vivo u kuuch proteínas basadas ti' lípidos ku clasifican ti' kúuchilo'ob jo'osa'al bisbil ba'alche'obo' selectivas ti' le bejo' secretoría, ka revela u k'a'ana'anil le longitud tsolokbal acil utia'al u selectividad clasificación. Utilizando jump'éel nu'ukulil microscopía potente yéetel vanguardista llamada SCLIM, demostramos le recién sintetizado Gas1-GFP (jump'éel noj bejo' membrana plasmática GPI-AP yéetel juntúul tsolokbal acil jach chowak (C26) ceramida porción lípido) ti' levadura ) Le regiones agrupadas ti' ERs discretos ku asocian yéetel ERES específicas, ka' jo'op' u le proteínas transmembrana ku distribuyen yo'osal le membrana ERRES ku distribuyen yo'osal le membrana ERRES (Yoochel 1). Beyxan, le ka'ap'éel tipos mercancías ku yokol ti' jejeláas ERES selectivamente (yoochel 2). Le longitud tsolokbal acil ti' le ceramida celular ti' le membrana ku reduce u C26 u C18-C16, le clúster Gas1-GFP ku interrumpe ti' le región ER discreta, ka Gas1-GFP ku redirige utia'al u p'atik le ER yéetel le proteína transmembrana yo'osal le bak'paach ERES (yoochel 3 yéetel yoochel 3). 4).
Kex GPI-AP meyajtiko'ob jump'éel mecanismo proteína especializada utia'al u jóok'ol ER, k encontramos u separación dependiente u ceramida C26 ma' u basa ti' interacciones proteínas diferenciales u páajtal u conducir ti' le especialización ERES (Figuras S4 yéetel S5). Tu kúuchilo'ob, k hallazgos apoyan jump'éel mecanismo clasificación alternativa impulsado tumen le agrupación proteínas basadas ti' lípidos yéetel posterior exclusión uláak' kuuch. K observaciones indican u le región Gas1-GFP wa clúster asociado yéetel juntúul ERES específico mina'an ti' le proteína secretada transmembrana Mid2-iRFP, ku indica u le clúster GPI-AP dependiente ti' le ceramida C26 facilitará u entrada ti' le ERES pertinente, ka in wéet k'iin, excluir transmembrana Le secreciones ku yokol ti' le ERES tu particular (Figuras 2 yéetel ERES). U jela'anil, u yaantal C18-C16 ceramidas ti' le membrana ER ma' causa GPI-AP utia'al u formar regiones wa racimos, bey u ma' excluyen wa reemplazan proteínas secretadas transmembrana ti' le k'iino' je'el xano' ERES (Figuras 3 yéetel 4). . Le o'olale', k proponemos u le ceramida C26 impulsa le separación yéetel le clasificación facilitando le agrupación proteínas vinculadas ti' ERES específicos.
Bix u kaxta'al u yúuchul le agrupación dependiente ti' le ceramida C26 ti' jump'éel yo'osal ER específica? Le tendencia u separar u ceramida le membrana lateralmente je'el u páajtal u causar GPI-AP yéetel C26 ceramida utia'al u formar mejen yéetel instantáneamente ordenados lípidos ti' le entorno lipídico asab irregular ti' le membrana ER ku taasik glicerolípidos asab Kóomtak yéetel insaturados. Clústeres de calidad (17, 18). Le mejen racimos temporales je'el u páajtal u asab fusionados ti' racimos asab nukuch, asab estables ka' u unir u ti' le complejo p24 (34). Je'el bix le je'ela', k e'esik u C26 Gas1-GFP k'a'abéet u interactuar yéetel le complejo p24 utia'al u formar racimos visibles asab nukuch (yoochel 3). Le complejo p24 jach jump'éel oligómero heterocigoto compuesto tumen kantúul jejeláas proteínas transmembrana p24 ti' levadura (35), ku proporciona unión multivalente, ku páajtal conducir ti' le reticulación cruzada ti' mejen racimos GPI-AP, generando tune' asab nojoch racimos estable (34). Le interacción ichil le ectodominios proteínas ti' GPI-APs xan je'el contribuir ti' u agregación, bey ku ye'esik ichil u transporte Golgi ti' células epiteliales polarizadas u mamíferos (36). Ba'ale', le ken u yaantal le ceramida C18-C16 ti' le membrana ER, le ken u complejo p24 ku une ti' Gas1-GFP, ma' u formarán nukuch racimos separados. Le mecanismo subyacente je'el u páajtal u depender ti' le propiedades físicas yéetel químicas específicas ti' le ceramida tsolokbal acil chowak. Xook biofísicos ti' le membranas artificiales muestran u kex le ceramidas tsolokbal acil chowak (C24) yéetel Kóomtak (C18-C16) páajtal causar separación fase, chéen le ceramidas tsolokbal acil chowak (C24) páajtal promover ka'anal curvatura yéetel flexión le cha'ano' utia'al u k'ex le cha'ano'. Yo'osal u referencia mutua (17, 37, 38). Ts'o'ok u ye'esa'al u le hélice transmembrana ti' TMED2, le homólogo humano ti' Emp24, interactúa selectivamente yéetel le esfingomielina basada ti' ceramida C18 ti' le lóbulos citoplasmáticos (39). Utilizando simulaciones dinámica molecular (MD), encontramos u ambas C18 yéetel C26 ceramidas acumulan mentik kex le lóbulos citoplasmáticos ti' le hélice transmembrana Emp24, ka yaan ti'ob preferencias similares (Figura S6). K'a'ana'an u ya'ala'ale' le je'ela' ku ye'esik u le hélice transmembrana ti' Emp24 je'el conducir ti' distribución asimétrica ti' le lípidos ti' le membrana. Lela' jump'éel resultado reciente basado ti' células mamíferos. Simulaciones MD similares xan muestran u yaantal lípidos éter (40) . Le o'olale', k especulamos u C26 ceramida ti' le ka'ap'éel lóbulos ER26 jach enriquecido localmente. Le ken GPI-AP ti' le lóbulos luminales ku une Jun ti' p24 multivalente yéetel le acumulación ceramida C26 mentik kex p24 ti' le lóbulos citoplasmáticos, je'el u páajtal u promover le agregación proteína acompañante yéetel curvatura le membrana ku generan yo'osal le yaal (41), causando GPI-AP u separar u ti' regiones discretas adyacentes ti' ERES, ku favorece xan le regiones curvadas ka'anal le membrana ER (42). Le informes anteriores apoyaron le mecanismo propuesto (43, 44). Le unión multivalente ti' le oligolectinas, patógenos wa anticuerpos ti' le glicosfingolípidos basados ​​ti' ceramida (GSL) ti' le membrana plasmática desencadena nuxi' agregación GSL, mejora le separación fases yéetel causa deformación yéetel internalización le membrana (44). Iwabuchi etc. (43) Kaxta'ab u tu taan cadenas acilo chowaktako'ob (C24) Ba'ale' ma' Kóomtak (C16), le ligando multivalente unido ti' le lactosilceramida GSL indujo le formación nukuch racimos yéetel invaginación le membrana, yéetel le transducción señal mediada tumen Lyn ti' le citoplasma ti' le folletos jach interdigida tumen jump'éel cadenas neutrófilos ti' parejas.
Ti' le células epiteliales polarizadas ti' le mamíferos, le concentración le páawo'ob anti-Golgi (TGN) ti' le nivel le membrana plasmática apical controla le separación yéetel clasificación GPI-AP (10, 45). Le agregación jach impulsada tumen le oligomerización GPI-AP (36), ba'ale' xan je'el depender ti' le longitud tsolokbal ceramida k encontramos ti' le levadura. Kex le GPI-AP mamífero yaan ti' jump'éel ancla basada ti' lípidos éter, yéetel u ba'ax química jach jela'an u le ceramida tsolokbal acil jach chowak, jump'éel xook reciente tu kaxtaj u ambas lípidos yaan evolutivamente similares propiedades físicas yéetel químicas yéetel función (40). Le o'olale', le nu'ukulil lípido éter ti' células mamíferos je'el u páajtal u similar ti' le ceramida C26 ti' le levadura, ka u ju'un jach u asociar yéetel le ceramida chowak tsolokbal ti' le membrana utia'al u fomentar le agregación yéetel clasificación GPI-AP. Kex le posibilidad láayli' k'a'abéet u probada Jun, hallazgos anteriores apoyan u le transporte le ceramida tsolokbal acil chowak ti' u wíinkilal Golgi ma' u bisik ka'ansaj tumen proteínas transferencia citoplasmática, ba'ale' yaantal yo'osal u síntesis anclas GPI bey le levadura. Le o'olale', le mecanismo conservador evolutivo bey u páajtal u co-transportar selectivamente ceramida u tsolokbal acil jach chowak yéetel GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ti' le bak'paach vesícula transporte.
Ti' le sistemas células epiteliales polarizadas ti' le levadura yéetel le mamíferos, le agregación GPI-AP yéetel le separación ti' uláak' proteínas membrana plasmática tuláakal ocurren bey ma' k'uchul u superficie le célula. Paladino et al. (48) tu kaxtaj u ti' le TGN u células epiteliales polarizadas u mamíferos, le agrupación GPI-AP ma' chéen k'a'abéet utia'al u clasificación selectiva u GPI-APs ti' le membrana plasmática apical, sino xan regula le organización agrupación GPI-APs yéetel u actividad biológica. U yich le célula. Ti' le levadura, le xooko' tu ye'esaj u le clúster GPI-AP dependiente ti' le ceramida C26 ti' le ER je'el u páajtal u regular le organización le clúster yéetel le actividad funcional ti' GPI-AP ti' le membrana plasmática (24, 49). Je'el bix le modeloa', le células GhLag1 ku alérgicas ti' le inhibidores GPI wa fármacos ku afectan le integridad le pak'o' celular (28), yéetel le necesidad u racimos Gas1-GFP funcionales (49) ti' le ceramida xnuk proyectada ti' le apareamiento células levadura indica G Posibles consecuencias fisiológicas ti' le células hLag1. Ba'alo' GPI-AP. Ba'ale', uláak' pruebas wa le organización funcional ti' le superficie le célula ts'o'ok sido programada tak le ER tumen juntúul método clasificación basado ti' longitud lípidos yaan u beel le chun tuukulo' k investigación futura.
Le cepas Saccharomyces cerevisiae utilizadas ti' le meyaja' ku enumeran ti' le tabla S1. Le cepas MMY1583 yéetel MMY1635 ti' SCLIM utia'al u imagen células vivas bino'ob construidas ti' le ka'a W303. Le cepas ku expresan Sec13-mCherry yéetel juntúul etiqueta proteína fluorescente bino'ob construidas utilizando jump'éel método basado ti' reacción ti' tsolokbal u polimerasa (PCR) yéetel plásmido pFA6a bey juntúul plantilla (23). Le cepa ku expresa Mid2-iRFP etiquetada yéetel proteína fluorescente yáanal le kaambalil yo'osal le promotor GAL1 bin construida bey Chúuns. Amplificación PCR ti' le secuencia iRFP-KanMx ti' le vector pKTiRFP-KAN (si'ipil E. O'Shea, meyaj ku plásmido Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificador u nu'ukulo'ob investigación (RRID): Addgene_64687) Ka insertado ti' le Ctermino endogenous ti' 22. Le ken u secuencia le genoma Mid2-iRFP bin amplificada yéetel clonada ti' le promotor GAL1, bin integrada ti' le ts'ono'oto' Not I-Sac I ti' le plásmido integración pRS306. Le plásmido pRGS7 resultante bin linealizado yéetel Pst I utia'al u integrar ti' le locus URA3.
Le gen fusión Gas1-GFP ku expresa yáanal le kaambalil yo'osal le promotor GAL1 ti' le plásmido centrómero (CEN), ku construye bey Chúuns. Le secuencia Gas1-GFP bin amplificada tumen PCR ti' le plásmido pRS416-GAS1-GFP (24) (siibal L. Popolo) yéetel clonada ti' le ts'ono'oto' Xma I-Xho I ti' le plásmido CEN pBEVY-GL LEU2 (siibal C) . Miller; Addgene plásmido meyaj ku 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Le plásmido ku jóok'olo' tu k'aaba'taj pRGS6. Le gen fusión Axl2-GFP xan u expresa yáanal le kaambalil yo'osal le promotor GAL1 ti' le vector pBEVY-GL LEU2, ka u construcción jach bey Chúuns. Le secuencia Axl2-GFP bin u amplificada u plásmido pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) tumen PCR, ka clonada ti' le ts'ono'oto' Bam HI-Pst I ti' le vector pBEVY-GL LEU2. Le plásmido ku jóok'olo' tu k'aaba'taj pRGS12. U tsol le oligonucleótidos utilizados ti' le xooko' ku chíikpajal ti' le tabla S2.
Le cepa bin complementada yéetel 0.2% adenina yéetel 2% glucosa [YP-dextrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-rafinosa] ayik'al levadura extracto proteína p (YP) chúumuk (1 % Extracto levadura yéetel 2% proteína ept). (YPR)] wa 2% galactosa [YP-galactosa (YPG)] bey fuente carbono, wa ti' jump'éel chúumuk mínimo sintético (0.15% k'oja'ano'obo' nitrógeno levadura yéetel 0.5% sulfato amonio) utia'al u complementar aminoácidos apropiados yéetel bases k'a'abeto'ob utia'al u nutrición , Ka ku taasik 2% glucosa glucosa (2% chúumuk glucótico) wa chúumuk mínimo galactosa (galactosa sintética chúumuk mínimo) bey jump'éel fuente carbono.
Utia'al u yila'al tu k'iinil xíimbal tumen, le células mutantes sec31-1 sensibles ti' le temperatura ku expresan le construcción yáanal le promotor GAL1 bino'ob cultivadas ti' chúumuk YPR ti' 24 ° c ichil áak'ab tak chúumuk fase log. Ka' u inducción ti' YPG ti' 24 ° c ichil 1 p'isib, le células bino'ob incubadas ti' SG ti' 37 ° c ichil 30 minutos, ka tu láak' transferidas ti' 24 ° c utia'al u liberar ti' le bloque secreción. Concanavalin A bin utilizado utia'al u fijar le células ti' jump'éel diapositiva vidrio yéetel imágenes tumen SCLIM. SCLIM leti' jump'éel combinación u microscopio u fluorescencia invertida Olympus IX-71 yéetel lente u k'aab tsaats u apertura numérica UPlanSApo 100 × 1.4 (Olympus), escáner confocal u disco giratorio u ka'anal velocidad yéetel ka'anal relación señal-ruido (Yokogawa Electric), espectrómetro personalizado, sistema intensificador u imágenes le imágenes (Hamamatsu Photonics) je'el u páajtal u ts'aik jump'éel t.u.m lupa yéetel jump'éel aumento final u ×266.7 yéetel juntúul cámara dispositivo acoplado ti' kuuch ku multiplica electrones (Hamamatsu Photonics) (21). U ch'a'abal wíimbala' ku beeta'al yéetel jump'éel software personalizado (Yokogawa Electric). Utia'al u yoochel 3D, utilizamos jump'éel actuador piezoeléctrico personalizado utia'al u vibrar le lente objetivo verticalmente, ka recogimos le páajtal a ópticas 100 nm aparte ti' jump'éel pila. Le wíimbala' Z-stack ku sutk'esiko'ob ti' datos voxel 3D, yéetel le función teórica u difusión ch'aaj utilizada utia'al u microscopio confocal disco giratorio ku meyajtiko'ob utia'al u procesamiento deconvolución tumen software Volocity (PerkinElmer). Yo'osal u búukinta'al software Volocity utia'al u umbral automáticamente utia'al u análisis co-localización, ERES incluyendo kuuch bin u P'iis. U xak'alil u internet ichil u beeta'al yéetel software MetaMorph (Molecular Devices).
Meyaj le software GraphPad Prism uti'al a wilik u k'a'ana'anil le estadísticao'. Utia'al u t-test Student's ka'ap'éel colas yéetel le prueba ordinaria u análisis u varianza (ANOVA) unidireccional, diferencias ichil le múuch'o'ob ku consideran yaantal jump'éel impacto significativo ti' P <0.05 (*).
Utia'al u microscopía fluorescencia u Gas1-GFP, le células fase log ku cultivaron ichil áak'ab ti' YPD yéetel recogidas tumen centrifugación, lavadas ka'ap'éel Óoxten yéetel solución salina tamponada yéetel fosfato, ka incubadas yóok'ol hielo tumen Ba'axten lo bey 15 minutos, ka tu láak' procedió yáanal le microscopio bey descrito ka'achij Check (24). Le microscopio Leica DMi8 (HCX PL APO 1003 leti' 1.40 tsaats PH3 CS) equipado yéetel juntúul lente objetivo, filtro L5 (GFP), cámara Hamamatsu yéetel software Application Suite X (LAS X) bin utilizado utia'al u adquisición. .
Le muestras bino'ob desnaturalizadas yéetel tampón muestra SDS ti' 65 ° c ichil 10 minutos, ka tu láak' separadas tumen electroforesis ti' gel SDS-poliacrilamida (PAGE). Utia'al u análisis inmunoblotting, 10 μl u muestra bin u cargado tumen carril. Anticuerpo primario: Meyaj anti-Gas1 policlonal conejo ti' jump'éel dilución 1:3000, anti-Emp24 policlonal conejo ti' jump'éel dilución 1:500, yéetel anti-GFP policlonal conejo (jump'éel siibal H. Riezman) ti' jump'éel dilución 1:3000. Le anticuerpo monoclonal anti-Pgk1 ti' le ch'o'o' bin utilizado ti' jump'éel dilución 1:5000 (jump'éel siibal J. de la Cruz). Anticuerpo secundario: peroxidasa de rábano (HRP) conjugada de chivo anti-conejo inmunoglobulina G (IgG) utilizada ti' jump'éel dilución 1:3000 (Pierce). HRP-conjugado chivo anti-ch'o' IgG bin utilizado ti' jump'éel dilución 1:3000 (Pierce). Le kúuchil núukik inmune bin u observada tumen le método quimioluminiscencia ti' le reactivo SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Bix u ya'alik ti' (31), jump'éel experimento inmunoprecipitación ku yúuchul u beeta'al ti' le fracción ER enriquecida. Tu ke, p'o'ik le células levadura yéetel tampón TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonilo fluoruro yéetel mezcla inhibidor proteasa) ti' 600 nm ( OD600) ti' 100 densidad óptica ka'ap'éel Óoxten. Jaatal yéetel perlas vidrio, ka tu láak' le escombros celular yéetel perlas vidrio bino'ob eliminados tumen centrifugación. Le sobrenadante bin túun centrifugado ti' 17.000 g ichil 15 minutos ti' 4 ° c. Le pellet bin u resuspendido ti' TNE yéetel saponina digitalis bin u añadida ti' jump'éel concentración final ti' le 1 ti chúumuk. Le suspensión bin u incubada ichil 1 p'isib yéetel rotación ti' 4 ° c, ka tu láak' le componentes insolubles bino'ob eliminados tumen centrifugación ti' 13.000 g ti' 4 ° c ichil 60 minutos. Utia'al u inmunoprecipitación Gas1-GFP, yáax pre-incubar le muestra yéetel perlas agarosa vacías (ChromoTek) ti' 4 ° C ichil 1 p'isib, ka tu láak' incubar yéetel GFP-Trap_A (ChromoTek) ti' 4 ° C ichil 3 horas. Le perlas inmunoprecipitadas bino'ob lavadas Kanp'éel Óoxten yéetel TNE ku taasik 0.2 ti chúumuk digoxigenina, eluídas yéetel tampón muestra SDS, separadas ti' SDS-PAGE, ka analizadas tumen inmunoblotting.
Bix u ya'alik ti' (31), u determinación le reticulación cruzada u realizó ti' le fracción ER enriquecida. Tu kóom t'aan, le fracción ER enriquecida bin u incubada yéetel 0.5 mM dithiobis (succinimidil propionato) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Le reacción reticulación bin u apagada tumen le adición glicina (50 mM concentración final, 5 minutos, 20 ° c).
Bix u ya'ala'al ka'achij (50), u beeta'al análisis MS ti' ceramida ti' cepas wild-type yéetel GhLag1. Tu ke, le células bino'ob cultivadas ti' fase exponencial (3 u 4 OD600 unidades leti' ml) ti' YPD ti' 30 ° c, ka 25 × 107 células bino'ob cosechadas. U metabolismo ku xu'ulul yéetel ácido tricloroacético. Meyaj disolvente extracción [etanol, ja', éter, piridina yéetel 4.2 N hidróxido amonio (15:15:5:1:0.018 v leti' v)] yéetel 1.2 nmol u calidad interna estándar C17 ceramida (860517, lípido polar Avanti)). Meyaj reactivo monometilamina [metanol, ja', n-butanol yéetel solución metilamina (4:3:1:5 v/v)] utia'al u meentik hidrólisis alcalina O'olkij ti' le extracto, ka tu láak' meyaj n-butanol saturado yéetel ja' utia'al u desalintar. Tu ts'ooke', le extracto bin u resuspendido ti' jump'éel disolvente modo positivo [cloroformo leti' metanol leti' ja' (2:7:1) + 5 mM acetato amonio] yéetel inyectado ti' le espectrómetro masas. Utia'al u yila'al yéetel u p'iis le moléculas esfingolípidas, beeta'ab jump'éel monitoreo multi-reacción (MRM). Le espectrómetro u juuch' cuadrupolo terciario TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) táan equipado yéetel juntúul fuente iones nanoflujo robótico Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) utia'al u análisis lípidos. Le energía colisión jach optimizada utia'al Amal categoría ceramida. Le datos MS bino'ob obtenidos ti' modo positivo. Utia'al Amal replicado biológico, le señal lipídica jach u mediana óoxp'éel mediciones independientes.
Bix u ya'alik ti' (31), le células (800×107) ku expresan Gas1-GFP bino'ob sometidas ti' inmunoprecipitación ku yúuchul. Le Gas1-GFP purificado bin separado tumen SDS-PAGE yéetel transferido ti' jump'éel membrana fluoruro polivinilideno (PVDF). Le proteína bin u visualizada tumen tinción PVDF yéetel negro amida. Le banda Gas1-GFP bin ch'ak ti' le PVDF yéetel p'o'ik 5 Óoxten yéetel metanol yéetel juntéene' yéetel ja' grado cromatografía líquida-MS (LC-MS). Yo'osal u incubación le tira membrana yéetel 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), tampón yéetel 500μl recién disuelto 1 M mezcla nitrito sodio ti' 37°C ichil 3 horas, le fracción lípida ku libera u Gas1-GFP yéetel lisiada Liberación u inotefosofamina ichil gluefaodeit yéetel ceraeit (51). Ka' lelo', le tira membrana bin lavada Kanp'éel Óoxten yéetel ja' grado LC-MS, secado u temperatura ambiente, ka almacenado ti' jump'éel atmósfera nitrógeno ti' -80 ° C tak u análisis. Bey kaambalil yo'osal, jump'éel muestra ti' sak u membrana PVDF u utilizado utia'al Amal experimento. Le lípido extraído ti' Gas1-GFP bin túun analizado tumen MS bey descrito (50). Tu ke, tiras PVDF ku ya'alik GPI-lípido bino'ob resuspendidas ti' 75μl disolvente moho negativo [cloroformo leti' metanol (1:2) + 5 mM acetato amonio] yéetel máan electrospray ionización (ESI)-MRM leti' MS Análisis u especies esfingolípidos (TSQ Vantage). Te' súutuka', u datos MS u obtuvieron ti' modo iones negativos.
Bix u ya'ala'al ka'achij, le porción lipídica ti' le ancla GPI bin separada ti' le [3H]-inositol-etiquetado GPI-AP (16). Le lípidos bino'ob separados tumen cromatografía u capa bek'ech utilizando juntúul t.u.m disolvente (55:45:10 cloroformo-metanol-0.25% KCl) yéetel visualizados utilizando FLA-7000 (Fujifilm).
Le células ku expresan Gas1-GFP (600 × 107) bino'ob lavadas ka'ap'éel Óoxten yéetel tampón TNE yéetel tampón TNE, ka Jaatal yéetel perlas vidrio, ka tu láak' centrifugadas utia'al u luk'ul Teeche' escombros celulares yéetel perlas vidrio. Le sobrenadante bin túun centrifugado ti' 17.000 g ichil 1 p'isib ti' 4 ° c. Le pellet bin p'o'ik ti' TNE yéetel incubado yéetel 1 U PI-PLC (Invitrogen) ti' TNE ku taasik 0.2% digitalis saponin ichil 1 p'isib ti' 37°C. Ka' u Ts'a'akal le enzima, le membrana bin eliminada tumen centrifugación ti' 17.000 g ti' 4 ° C ichil 1 p'isib. Utia'al u inmunoprecipitar Gas1-GFP, le sobrenadante bin incubado yéetel GFP-Trap_A (ChromoTek) ti' 4 ° C ichil áak'ab. Le Gas1-GFP purificado separado tumen SDS-PAGE bin manchado yéetel azul brillante Coomassie. Le banda tinción Gas1-GFP bin ch'ak ti' le gris rodeando le acueducto, ka tu láak' ka' alquilación yéetel yodoacetamida yéetel reducción yéetel ditiotreitol, u realizó digestión ti' gel yéetel tripsina. Extraer yéetel tikintaj péptidos trípticos yéetel péptidos yéetel GPI-glucanos. Le péptido seco bin u disuelto ti' 20 μl ja'. Inyectar jump'éel jaats (8μl) ti' le LC. Utia'al u separar le péptidos yáanal condiciones gradiente específicas, meyajnaj jump'éel columna octadecilsilano (Develosil 300ODS-HG-5; metros interior 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Prefectura de Aichi, Japón). Le fase móvil jach disolvente A (0.08% ácido fórmico) yéetel disolvente B (0.15% ácido fórmico ti' 80% acetonitrilo). Juntúul t.u.m Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) bin utilizado utia'al u eluir le columna yéetel disolvente A ichil 55 minutos ti' jump'éel caudal 50 μl min-1 ichil 5 minutos, ka tu láak' le concentración disolvente B bin u ya'abtal ti' le 40 ti chúumuk. , Estados Unidos). Le eluado bin introducido continuamente ti' le fuente iones ESI, ka le péptidos trípticos yéetel péptidos yéetel GPI-glycanos bino'ob analizados tumen LTQ Orbitrap XL (espectrómetro u juuch' trampa-orbitrap iones lineales híbridos; Thermo Fisher Scientific). Ti' le configuración MS, le voltaje le fuente capilar bin establecido ti' 4.5 kV, yéetel le temperatura le capilar transferencia bin mantenida ti' 300 ° c. Le voltaje capilar yéetel le voltaje le lente tubo bino'ob establecidos ti' 15 V yéetel 50 V, respectivamente. Le datos MS bino'ob obtenidos ti' le modo iones positivos (resolución u 60.000; exactitud juuch' 10 pak'chaje' tumen millón) ti' jump'éel rango juuch' 300 leti' m leti' z relación juuch' leti' kuuch (m leti' z) 3000. Le datos MS leti' MS ku obtienen yo'osal le trampa iones ti' le LTQ órbita órbita LTQ [XL XL, le yáax dígitos dependen ti' le datos ku dependen ti' le yáax dígitos disociación inducida tumen colisión (CID)].
Le simulaciones MD u realizaron utilizando software GROMACS (52) yéetel MARTINI 2 force field (53-55). Le CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) bin túun utilizado utia'al u construir jump'éel bicapa ku taasik dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) yéetel Cer C18 wa DOPC yéetel Cer C26. Le topología yéetel le coordenadas Cer C26 ku jóok'ol ti' DXCE tumen luk'ul Teeche' le perlas extras ti' u nej le esfingosina. Meyaj le tuukula' descrito in continuación utia'al u equilibrar le doble capa yéetel ejecutar tu, ts'o'okole' meyaj le ts'ook coordenadas le yaan utia'al u construir juntúul t.u.m ku taasik Emp24. Le dominio transmembrana ti' le levadura Emp24 (residuos 173 u 193) bin construido bey juntúul α-hélice utilizando le nu'ukula' visual MD (VMD) ba'ax molecular (58). Tu láak', ka' luk'ul Teeche' le lípidos superpuestos, le proteína bin gruesamente granulada yéetel insertada ti' le bicapa utilizando CHARMM GUI. Le yaan final ku taasik 1202 DOPC yéetel 302 Cer C26 wa 1197 DOPC yéetel 295 Cer C18 yéetel Emp24. Ionizar le yaan ti' jump'éel concentración 0.150M. Kanp'éel réplicas independientes bino'ob u hechas utia'al u ka'ap'éel composiciones bicapa.
Le bicapa lipídica ku equilibra utilizando le tuukula' CHARMM GUI, ku implica minimizar ka tu láak' equilibrar 405.000 wook, tu'ux le restricciones posición ku reducen jujump'íitil yéetel eliminadas, ka le paso k'iin ku ya'abtal u 0.005 ps u 0.02 ps. Ka' u equilibrio, ku beetik 6 μs yéetel jump'éel paso k'iin 0.02 ps. Ka' insertar Emp24, meyaj le k'iino' je'el xano' tuukula' GUI CHARMM utia'al u minimizar yéetel equilibrar le yaan, ka tu láak' ejecutar ichil 8 s ti' producción.
Utia'al tuláakal le kaambalilo'ob, ichil le tuukula' equilibrio, le presión jach controlada tumen le barostato Berendsen (59), ka ichil le tuukula' producción, le presión jach controlada tumen le barostato Parrinello-Rahman (60). Ti' tuláakal le ku, le presión chúumuk jach 1 bar yéetel ku meyajtiko'ob jump'éel esquema acoplamiento presión semi-isotrópica. Ti' le tuukula' equilibrio yéetel producción, ku meyajtiko'ob jump'éel termostato (61) yéetel recalibración velocidad utia'al u acoplar le temperatura partículas proteínas, lípidos yéetel disolventes respectivamente. ichil tuláakal le meyajo', le temperatura objetivo jach 310K. Le interacción ma' unión ku calcula generando jump'éel tsoolol emparejamiento utilizando le esquema Verlet yéetel 0.005 ti' máansaj óolal ti' le búfer. Le término Coulomb ku calcula utilizando le sikte reacción yéetel juntúul distancia corte u 1.1 nm. Le término Vander Waals meyajtiko'ob jump'éel esquema corte yéetel juntúul distancia corte 1.1 nm, yéetel le esquema corte Verlet ku meyajtiko'ob utia'al u deriva potencial (62).
Utilizando VMD, le longitud onda corte ichil le perlas fosfato DOPC wa perlas ceramida AM1 yéetel le proteína jach 0.7 nm, yéetel le meyaj ku lípidos ku interactúan yéetel le proteína ku calcula. Je'el bix u ya'alik le fórmula je'ela', calcular le factor agotamiento-enriquecimiento (DE) bey ti' (63): factor DE = (le cantidad lípidos totales ti' le proteína 0.7) ti' le proteína 0.7 (le cantidad Cer ti' le lípidos totales)
Le je'o' ku ya'ala'alo' ku k'amik bey jump'éel promedio, yéetel le barras ba'alo' ku kantúul copias independientes ti' SE. Le significado estadístico ti' le factor DE ku calcula tumen prueba t [(averageDE-factor-1) leti' SE]. Calcular le je'o' P ti' le distribución jump'éel cola.
Le nu'ukula' GROMACS bin utilizada utia'al u calcular le mapa densidad lateral 2D ti' le yaan ku taasik Emp24 ichil le ts'ook 250 ns ti' le rastro. Utia'al u kéen p'áatak le mapa enriquecimiento leti' agotamiento ceramida, le mapa densidad Cer u jats tumen le suma le mapa Cer yéetel DOPC, ka tu láak' jats tumen le concentración Cer ti' u wíinkilal. ku meyaj le escala mapa u boonilo'.
Utia'al u yantal uláak' ba'alo'ob uti'al le artículoa', wil http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Lela' jump'éel artículo u muuk' abierto distribuido yáanal le términos le licencia Creative Commons Attribution-Non-Commercial, ku cha'antik u búukinta'al, distribución yéetel reproducción ti' je'el ba'ax medios, siempre yéetel ken u búukinta'al final ma' u utia'al u ganancia comercial yéetel le premisa jach u le meyajo' áantajil jach correcto. Reeferensia.
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Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Pérez -Lingio Sererope), Wazerope (Serhopez), Logaz (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imágenes 3D u ka'anal resolución tu k'iinil xíimbal tumen revela u k'a'ana'anil u longitud le tsolokbal ceramida utia'al u clasificación proteínas ti' le lu'umo'oba' salida selectiva.
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©2020 Asociación Americana utia'al u táanil le ciencia. tuláakal u páajtalilo'ob. AAAS leti' jump'éel socio ti' HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef yéetel COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.