Le metabolitos inmunomoduladores ku jump'éel característica clave ti' le microentorno tumoral (TME), ba'ale' yéetel Jayp'éel excepciones, u identidades permanecen tu gran medida desconocidas. Te'ela', analizamos tumores yéetel células T ti' le tumores yéetel ascitis k'oja'ano'ob yéetel carcinoma seroso u ka'anal grado (HGSC) utia'al u revelar le metaboloma le k'iino'oba' jejeláas compartimentos TME. Le ascitis yéetel le células tumorales yaan ti'ob amplias diferencias metabolitos. Ti' comparación yéetel le ascitis, le células T infiltradas ti' le tumor ku enriquecen significativamente ti' 1-metilnicotinamida (MNA). Kex le nivel MNA ti' le células T jach elevado, le expresión nicotinamida N-metiltransferasa (jump'éel enzima ku cataliza le transferencia múuch' metílicos u S-adenosilmetionina u nicotinamida) u limita ti' le fibroblastos yéetel le células tumorales. Funcionalmente, MNA induce células T utia'al u secretar le factor necrosis tumoral citoquina promotora ti' le tumor alfa. Le o'olale', MNA derivado u TME contribuye ti' le regulación inmune ti' le células T yéetel representa jump'éel objetivo inmunoterapia potencial utia'al u Ts'a'akal le k'ak'as k'oja'anil cáncer humano.
Le metabolitos derivados ti' le tumores páajtal yaantal jump'éel efecto inhibidor profundo ti' le inmunidad antitumoral, ka asab yéetel asab pruebas muestran u xan páajtal meyaj bey jump'éel muuk' impulsora clave utia'al u progresión le k'oja'anil (1). Beyxan ti' kaambalilo'ob le efecto Warburg, meyaj ts'oonak ts'o'ok u comenzado u caracterizar le noj metabólico ti' le células tumorales yéetel u relación yéetel le noj inmune ti' le microentorno tumoral (TME). Xook ti' modelos ch'o' yéetel células T humanas ts'o'ok u demostrado u metabolismo glutamina (2), metabolismo oxidativo (3) yéetel metabolismo glucosa (4) páajtal actuar independientemente ti' jejeláas subgrupos células inmunes. Yaan metabolitos ti' le k'iino'oba' vías inhiben le función antitumoral ti' le células T. Ts'o'ok u ye'esa'al u bloqueo le coenzima tetrahidrobiopterina (BH4) je'el u páajtal u dañar le proliferación células T, ka le aumento BH4 ti' u wíinkilal je'el u páajtal u ma'alo'obkíinsiko'ob le núukik inmune antitumoral mediada tumen CD4 yéetel CD8. Beyxan, le efecto inmunosupresor ti' le kynurenina je'el u páajtal u salvado tumen le administración BH4 (5). Ti' le glioblastoma mutante ti' le isocitrato deshidrogenasa (IDH), le secreción enantiometabolico (R)-2-hidroxiglutarato (R-2-HG) inhibe le activación células T, proliferación yéetel actividad citolisis (6). Ts'oonak, ts'o'ok u ye'esa'al u metilglioxal, jump'éel subproducto ti' le glucólisis, ku beeta'al tumen células supresoras u origen mieloide, yéetel le transferencia células T ti' metilglioxal je'el u páajtal u inhibir le función células T efectoras. Ti' le Ts'a'akal, le neutralización metilglioxal je'el u páajtal u superar le actividad células supresoras derivadas u mieloide (MDSC) yéetel ma'alo'obkíinsiko'ob sinérgicamente le terapia bloqueo puesto ti' modelos ch'o' (7). Le xooko'oba' múuch' enfatizan le ju'uno' clave ti' le metabolitos derivados u TME ti' le regulación le función yéetel le actividad le células T.
Le disfunción células T ts'o'ok sido ampliamente reportada ti' le k'ak'as k'oja'anil cáncer u ovario (8). Lela' tu parte debido a le características metabólicas inherentes ti' le hipoxia yéetel le vasculatura tumoral anormal (9), ku resulta ti' le yokol k'ujo'ob ti' glucosa yéetel triptófano ti' subproductos bey ácido láctico yéetel kynurenina. Le lactato extracelular excesivo ku xu'ulsik u producción le interferón-γ (IFN-γ) yéetel ku bisik u diferenciación le subgrupos mielosupresores (10, 11). U jaanta'al triptófano Jun ku jets'ik u proliferación le células T yéetel ku jets'ik u señalización le receptor células T (12-14). Kex yaan le ba'alo'oba', ya'ab meyaj tu ba'pach le metabolismo inmune bin u bisik ka'ansaj ti' le cultivo células T in vitro utilizando medios optimizados, wa limitado ti' modelos ch'o' homólogos in vivo, mix juntúul ti' le ku refleja plenamente le heterogeneidad le cánceres humanos yéetel le entorno macro yéetel micro fisiológico.
jump'éel ba'al ku chíikpajal ti' le k'ak'as k'oja'anil cáncer ti' ovario jach u k'i'itpajal peritoneal yéetel u chíikpajal le ascitis. Le acumulación u líquido celular ti' le ascitis ku asocia yéetel k'oja'anil avanzada yéetel k'aak'as pronóstico (15). Je'el bix u ya'alik le informe'obo', le compartimento k'áate' jach hipóxico, yaan ka'anatako'ob niveles u factor tuméen endotelial vascular (VEGF) yéetel indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), yéetel táan infiltrado tumen células reguladoras T yéetel células inhibidoras mieloides (15-18). Le entorno metabólico ti' le ascitis je'el u páajtal u jela'an u le tumor je'el wéet, yo'olal le reprogramación células T ti' le kúuchil peritoneal ma' táan clara. Beyxan, le jela'anil yéetel le heterogeneidad ichil le ascitis yéetel le metabolitos presentes ti' le entorno tumoral je'el u páajtal u obstaculizar le infiltración células inmunes yéetel u función ti' le tumores, ka k'a'abéet asab investigación.
Utia'al u yutskíinta'al le talamilo'oba', k diseñamos jump'éel método separación celular sensible yéetel cromatografía líquida yéetel espectrometría u masas tándem (LC-MS leti' MS) utia'al u xook jejeláas tipos celulares (incluyendo CD4 + yéetel CD8 + células T) bey ichil yéetel ichil tumores U metabolitos abarcan células ti' le k'iino' je'el xano' entorno ascitis yéetel tumoral ti' le k'oja'ano'. Utilizamos le método ti' conjunción yéetel citometría flujo ka'anal dimensional yéetel secuenciación ARN monocelular (scRNA-seq) utia'al u ts'aik jump'éel retrato jach resuelto ti' le noj metabólico ti' le k'iino'oba' poblaciones clave. Le método tu ye'esaj jump'éel aumento significativo ti' le nivel 1-metilnicotinamida (MNA) ti' le células T tumorales, ka experimentos in vitro mostraron u le efecto inmunomodulador ti' le MNA ti' le función células T ka'ach desconocido ka'ache'. Tu general, le método revela le interacciones metabólicas mutuas ichil le tumores yéetel le células inmunes, ka proporciona visión única ti' le metabolitos regulación inmune, ku páajtal u útiles utia'al u Ts'a'akal le inmunoterapia k'ak'as k'oja'anil cáncer u ovario basado ti' células T Oportunidades u Ts'a'akal.
Meyajnajto'on citometría u flujo ka'anal dimensional utia'al u cuantificar simultáneamente le absorción glucosa [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desoxiglucosa (2-NBDG) yéetel actividad mitocondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (2017, 2019) táan u tséel marcadores típicos ku distinguen le células inmunes yéetel le poblaciones células tumorales (tabla S2 yéetel yoochel S1A). Le análisis tu ye'esaj u ti' comparación yéetel le células T, le ascitis yéetel le células tumorales yaan ti' niveles asab ka'anatako'ob u absorción glucosa, ba'ale' yaan diferencias asab mejen ti' le actividad mitocondrial. Le chúumuk absorción glucosa ti' le células tumorales [CD45-EpCAM (EpCAM) +] jach óoxp'éel wa kantéen Óoxten u le células T, yéetel le absorción chúumuk glucosa ti' le células T CD4 + jach 1.2 Óoxten le u células T CD8 +, ku indica u le linfocitos infiltrantes ti' le tumor (TIL) yaan jejeláas requisitos metabólicos incluso ti' le bak'paach figura TAME (Figura 1). U jela'anil, le actividad mitocondrial ti' le células tumorales jach similar ti' le células T CD4 +, yéetel le actividad mitocondrial ti' le ka'ap'éel tipos células asab ka'anal u le células T CD8 + (yoochel 1B). Tu general, le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob revelan le nivel metabólico. Le actividad metabólica ti' le células tumorales asab ka'anal u le células T CD4 +, yéetel le actividad metabólica ti' le células T CD4 + asab ka'anal u le células T CD8 +. Kex le k'iino'oba' táanil ichil le tipos celulares, mina'an mix jump'éel jela'anil in consistente ti' le noj metabólico ti' le células T CD4 + yéetel CD8 + wa u proporciones relativas ti' le ascitis ti' comparación yéetel le tumores (yoochel 1C). U jela'anil, ti' le fracción CD45-cell, le proporción células EpCAM + ti' le tumor aumentó ti' comparación yéetel le ascitis (yoochel 1D). Xan observamos jump'éel jela'anil in metabólica chika'an ichil EpCAM + yéetel EpCAM- componentes células. Le células EpCAM+ (tumor) yaan ti'ob asab absorción glucosa yéetel actividad mitocondrial u le células EpCAM-, ba'ax le jach asab ka'anal u le actividad metabólica ti' le fibroblastos ti' le células tumorales ti' TME (yoochel 1, E yéetel F).
(A yéetel B) Intensidad fluorescencia mediana (MFI) u absorción glucosa (2-NBDG) (A) yéetel actividad mitocondrial u células T CD4 + (MitoTracker rojo éek'joch'e'en) (B) Gráficos representativos (ts'íik lela') yéetel datos tabulados (K'abil beya'), células T CD8 + yéetel EpCAM + CD45-tumoral células bey cites yéetel tumores. (C) Le relación CD4 + yéetel CD8 + células (u CD3 + T células) ti' le ascitis yéetel le tumor. (D) Proporción u células tumorales EpCAM + ti' le ascitis yéetel le tumor (CD45−). (E yéetel F) EpCAM + CD45-tumor yéetel EpCAM-CD45-matriz absorción glucosa (2-NBDG) (E) yéetel actividad mitocondrial (MitoTracker rojo éek'joch'e'en) (F) gráficos representativos (ts'íik lela') yéetel datos tabulados ( K'abil beya') Ascitis yéetel células tumorales. (G) Gráficos representativos ti' le expresión CD25, CD137 yéetel PD1 tumen citometría u flujo. (H yéetel I) CD25, CD137 yéetel PD1 expresión ti' CD4 + células T (H) yéetel CD8 + células T (I). (J yéetel K) Fenotipos ingenuos, memoria central (Tcm), efector (Teff) yéetel memoria efector (Tem) basados ​​ti' le expresión CCR7 yéetel CD45RO. Máak representativas (ts'íik lela') yéetel datos tabulares (k'abil beya') u células T CD4 + (J) yéetel células T CD8 + (K) ti' ascitis yéetel tumores. P valores determinados tumen t-test emparejado (*P<0.05, **P<0.01 yéetel ***P<0.001). Le internet ichil ku chíikbesik k'oja'ano'ob emparejados (n = 6). FMO, fluorescencia menos uno; MFI, chúumuk intensidad fluorescencia.
Uláak' análisis tu ye'esaj uláak' diferencias significativas ichil le noj fenotípico u células T jach resuelto. Le activado (yoochel 1, G u I) yéetel le memoria efectora (yoochel 1, J yéetel K) ti' le tumores ku jach asab frecuentes u le ascitis (proporción u células T CD3 +). Bey xan, u xak'altik le fenotipo tumen le expresión marcadores activación (CD25 yéetel CD137) yéetel marcadores depleción [proteína u kíimile' celular programada 1 (PD1)] tu ye'esaj u kex le características metabólicas ti' le k'iino'oba' poblaciones ku jejeláas (Figura S1, B u E) , Ba'ale' ma' u observaron diferencias metabólicas significativas consistentemente ichil efectos memoria naiva, wa subconjunto (Figura S1, F1). TEEN). Le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob bino'ob confirmados yo'osal u búukinta'al métodos u kaambalil yo'osal le máquina utia'al u asignar automáticamente fenotipos celulares (21), ku asab reveló u yaantal jump'éel nuxi' meyaj ku u células u médula ósea (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ti' le ascitis le k'oja'ano' (Figura S2A ). ichil tuláakal le tipos celulares identificados, le jo'olkaajo' celulares mieloides tu ye'esaj le asab absorción glucosa yéetel actividad mitocondrial (yoochel S2, B u G). Le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob destacan le k'a'am diferencias metabólicas ichil le ya'ab k'oja'ano'ob tipos celulares encontrados ti' le ascitis yéetel le tumores ti' le k'oja'ano'ob HGSC.
Le noj talamil uti'al u na'ata'al u yáantajo'ob metabonómicas ti' TIL leti' u k'a'abéettal u aislar muestras células T u suficiente pureza, calidad yéetel cantidad ti' le tumores. Xook ts'oonak ts'o'ok u demostrado u métodos u clasificación yéetel enriquecimiento le perlas basados ​​ti' le citometría flujo páajtal conducir ti' cambios ti' le perfiles metabolitos celulares (22-24). Utia'al u xu'ulul le talamilo', k optimizado le método enriquecimiento perlas utia'al u aislar yéetel aislar TIL u k'ak'as k'oja'anil cáncer u ovario humano resecado quirúrgicamente bey ma' u análisis tumen LC-MS leti' MS (wil materiales yéetel métodos; yoochel 2A). Utia'al u p'iss bey le impacto global ti' le protocolo ti' le cambios metabolitos, comparamos le perfiles metabolitos ti' células T activadas tumen donantes saludables ka' le paso separación perlas anteriores yéetel células ma' bino'ob separadas perlas Ba'ale' permanecieron ti' hielo. Le análisis kaambalil yo'osal calidad tu kaxtaj yaan jump'éel ka'anal correlación ichil le k'iino'oba' ka'ap'éel condiciones (r = 0.77), yéetel le repetibilidad técnica ti' le múuch' 86 metabolitos yaan ka'anal repetibilidad (yoochel 2B). Le o'olale', le k'iino'oba' métodos páajtal u beetik jump'éel análisis metabolitos exactos ti' células ku someten ti' enriquecimiento bin yano'ob celular, proporcionando bey le yáax plataforma ka'anal resolución utia'al u identificar metabolitos específicos ti' HGSC, permitiendo bey ti' le máako'obo' náajaltik jump'éel asab taam comprensión le especificidad celular Cha'ana' metabolismo sexual.
(A) Diagrama esquemático u enriquecimiento le cuentas magnéticas. Táanil ti' u xak'alta'al tumen LC-MS/MS, le células yaan u máan óoxp'éel rondas consecutivas ti' enriquecimiento u cuentas magnéticas wa permanecerán yóok'ol hielo. (B) Le efecto bin yano'ob enriquecimiento ti' le abundancia metabolitos. U chúumuk óoxp'éel p'iis uti'al Amal bin yano'ob enriquecimiento ± SE. Le internet ichil gris ku chíikbesik jump'éel relación 1:1. Le correlación intra-xook (ICC) ti' le mediciones repetidas ku ye'esik ti' le etiqueta le bak'pach. NAD, nicotinamida adenina dinucleótido. (C) Diagrama esquemático ti' le flujo meyaj ti' le análisis metabolitos k'oja'ano'ob. Le ascitis wa le tumores ku ch'a'iko'ob ti' le k'oja'ano'obo' yéetel ku criopreservarta'alo'ob. jump'éel chan jaats ti' Amal muestra bin u analizada tumen citometría flujo, ka' jo'op' u le muestras restantes máan óoxp'éel rondas enriquecimiento utia'al u CD4 +, CD8 + yéetel CD45- células. Le k'iino'oba' fracciones celulares bino'ob analizadas utilizando LC-MS leti' MS. (D) Mapa u ooxoj u abundancia metabolitos estandarizados. Le dendrograma ku chíikbesik u agrupación Ward ti' le distancias euclidianas ichil le muestras. (E) Análisis de componentes principales (PCA) de la mapa de metabolitos de la muestra, ye'esik óoxp'éel replicas ti' Amal muestra, muestras ti' le k'oja'ano'obo' ku conectan tumen juntúul internet ichil. (F) Le PCA ti' le perfil metabolito ti' le muestra condicionada ti' le k'oja'ano' (es decir, utilizando redundancia parcial); le bin yano'ob muestra jach limitado tumen le casco convexo. PC1, componente noj bejo' 1; PC2, componente noj bejo' 2.
Tu láak', aplicamos le método enriquecimiento utia'al u analizar 99 metabolitos ti' le fracciones CD4 +, CD8 + yéetel CD45-cell ti' le ascitis primarias yéetel tumores seis k'oja'ano'ob HGSC (yoochel 2C, yoochel S3A yéetel tabla S3 yéetel S4). Le kaajnáalilo'obo' k'ana'an ju'uno'ob representan 2% u 70% ti' le muestra nojoch áantajil u células kuxa'an, yéetel le proporción células varía grandemente ichil le k'oja'ano'ob. Ka' u ja'atsal le perlas, le fracción enriquecida u k'ana'an ju'uno'ob (CD4 +, CD8 + wa CD45-) representa asab ti' le 85% ti' tuláakal le células vivas ti' le muestra tu promedio. Le método enriquecimiento ku cha'antik k analizar poblaciones celulares u metabolismo u wa'ak'al tumoral humano, ba'ax ma' táan u páajtal u beetik u nukuch muestras. Utilizando le protocolo, determinamos u l-kynurenina yéetel adenosina, le k'iino'oba' ka'ap'éel metabolitos inmunosupresores ma'alob caracterizados bino'ob elevados ti' células T tumorales wa células tumorales (Figura S3, B yéetel C). Le o'olale', le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob ku ye'esik u fidelidad yéetel Buka'aj u ba'al u k ma'alo'obtal separación celular yéetel espectrometría masas utia'al u kaxtik metabolitos biológicamente importantes ti' le tejidos k'oja'ano'ob.
K análisis xan tu ye'esaj jump'éel k'a'am separación metabólica ti' le tipos celulares ichil yéetel ichil le k'oja'ano'ob (yoochel 2D yéetel yoochel S4A). Tu particular, ti' comparación yéetel uláak' k'oja'ano'ob, le k'oja'ano' 70 tu ye'esaj jejeláas características metabólicas (yoochel 2E yéetel yoochel S4B), indicando u páajtal u yaantal heterogeneidad metabólica sustancial ichil le k'oja'ano'ob. K'a'ana'an u ya'ala'ale' u ti' comparación yéetel uláak' k'oja'ano'ob (1.2 u 2 litros; Tabla S1), le cantidad total u ascitis recogida ti' le k'oja'ano' 70 (80 ml) bin asab chan. Le kaambalil yo'osal le heterogeneidad interpaciente ichil le análisis componente noj bejo' (je'ebix, utilizando análisis redundancia parcial) ye'esik cambios consistentes ichil tipos celulares, yéetel le tipos celulares yéetel leti' wa microentorno ku agregan chika'an bin le perfil metabolito (Figura 2F ). Le análisis metabolitos k'áate' enfatizó le k'iino'oba' táanil yéetel reveló diferencias significativas ichil tipos celulares yéetel microentorno. K'a'ana'an u ya'ala'ale' le jela'anil asab extrema ku yila'alo' leti' le MNA, ku suele enriquecer ti' células CD45- yéetel ti' células CD4 + yéetel CD8 + ku infiltran ti' le tumor (yoochel 3A). Utia'al u células CD4 +, le efecto jach asab obvio, ka le MNA ti' le células CD8 + xan bey u fuertemente afectado tumen le ka'a jeets'. Ba'ale', lela' ma' jach k'a'anan, tumen chéen óoxtúul ti' le seis k'oja'ano'ob je'el u páajtal u evaluados utia'al u puntuaciones CD8 + tumoral. Beyxan ti' kaambalilo'ob MNA, ti' jejeláas tipos células ti' ascitis yéetel tumores, uláak' metabolitos ku k'aas caracterizados ti' TIL xan ku diferencialmente ayik'al (Figuras S3 yéetel S4). Le o'olale', le k'iino'oba' datos revelan jump'éel prometedor múuch' metabolitos inmunomoduladores utia'al u asab investigación.
(A) Contenido normalizado ti' MNA ti' CD4 +, CD8 + yéetel CD45- células u ascitis yéetel tumor. Le cuadro cuadro ye'esik le mediana (internet ichil), rango intercuartílico (bisagra marco) yéetel rango datos, tak 1.5 Óoxten le rango intercuartílico (bigote marco). Bix u ya'alik ti' materiales yéetel métodos k'oja'ano'ob, meyaj le je'o' limma le k'oja'ano' utia'al u determinar le je'o' P (*P<0.05 yéetel **P<0.01). (B) Diagrama esquemático ti' le metabolismo MNA (60). Metabolitos: S-adenosyl-1-metionine; SAH, S-adenosina-1-homocisteína; NA, nicotinamida; MNA, 1-metilnicotinamida; 2-PY, 1-metil- 2-piridona-5-carboxamida; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-carboxamida; NR, nicotinamida ribosa; NMN, mononucleótido nicotinamida. Enzimas (ya'ax): NNMT, nicotinamida N-metiltransferasa; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamida fosforibosil transferasa; AOX1, aldehído oxidasa 1; NRK, nicotinamida ribosida quinasa; NMNAT, nicotinamida mono Nucleotide adenilato transferasa; Pnp1, fosforilasa nucleósido purina. (C) t-SNE ti' scRNA-seq ti' ascitis (gris) yéetel tumor (rojo; n = 3 k'oja'ano'ob). (D) expresión NNMT ti' jejeláas poblaciones celulares identificadas utilizando scRNA-seq. (E) Expresión u NNMT yéetel AOX1 ti' SK-OV-3, riñón embrionario humano (HEK) 293T, células T yéetel células T tratadas yéetel MNA. Le expresión plegada ku ye'esik relativamente ti' SK-OV-3. Le patrón expresión yéetel SEM ku ye'esik (n = 6 donantes saludables). Le ba'alo'ob Ct asab ti' 35 ku yila'al bey ma' tu páajtal u yila'al (UD). (F) Expresión u SLC22A1 yéetel SLC22A2 ti' SK-OV-3, HEK293T, células T yéetel células T tratadas yéetel 8mM MNA. Le expresión plegada ku ye'esik relativamente ti' SK-OV-3. Le patrón expresión yéetel SEM ku ye'esik (n = 6 donantes saludables). Le ba'alo'ob Ct asab ti' 35 ku yila'al bey ma' tu páajtal u yila'al (UD). (G) Contenido MNA celular ti' células T donantes saludables activadas ka' 72 horas u incubación yéetel MNA. Le patrón expresión yéetel SEM ku ye'esik (n = 4 donantes saludables).
MNA ku beeta'al tumen u k'e'exel le múuch' metilo ti' S-adenosyl-1-metionine (SAM) ti' nicotinamida (NA) tumen nicotinamida N-metiltransferasa (NNMT; Figura 3B). NNMT ku sobreexpresa ti' jump'éel variedad cánceres humanos yéetel u asocia yéetel proliferación, invasión yéetel metástasis (25-27). Utia'al u ma'alo'obtal u na'ata'al u taal MNA ti' células T ti' TME, utilizamos scRNA-seq utia'al u caracterizar le expresión NNMT ichil tipos celulares ti' le ascitis yéetel tumores óoxp'éel k'oja'ano'ob HGSC (Tabla S5). U xak'alil yan 6,500 células tu ye'esaj ti' le ascitis yéetel le entornos tumorales, le expresión NNMT bin restringida ti' le presuntas fibroblastos yéetel le poblaciones células tumorales (yoochel 3, C yéetel D). K'a'ana'an u ya'ala'ale' mina'an mix jump'éel expresión NNMT obvia ti' je'el ba'ax jo'olkaajo' ku expresa PTPRC (CD45 +) (yoochel 3D yéetel yoochel S5A), ku indica u le MNA detectado ti' le espectro metabolitos ts'o'ok sido introducido ti' células T. U ye'esajil le aldehído oxidasa 1 (AOX1) ku sutk'esik MNA ti' 1-metil-2-piridona-5-carboxamida (2-PYR) wa 1-metil-4-piridona-5-carboxamida (4-PYR); Figura 3B) xan u restringe ti' le jo'olkaajo' fibroblastos expresando COL1A1 (Figura S5A), ku múuch' indican u le células T carecen ti' le Buka'aj u ba'al u metabolismo MNA convencional. Le patrón expresión le k'iino'oba' genes relacionados yéetel MNA bin verificado utilizando jump'éel segunda conjunto datos celulares independientes u ascitis u k'oja'ano'ob HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Beyxan, análisis cuantitativo u reacción ti' tsolokbal u polimerasa (qPCR) u células T donantes saludables tratadas yéetel MNA tu ye'esaj u ti' comparación yéetel kaambalil yo'osal SK-OV-3 células tumorales ováricas, NNMT wa AOX1 óol ma' bin expresado (yoochel 3E). Le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob inesperados indican u MNA je'el u páajtal u secretado ti' fibroblastos wa tumores ti' células T adyacentes ti' TME.
Kex le candidatos incluyen le ch'i'ibalil transportadores cationes orgánicos 1 u 3 (OCT1, OCT2 yéetel OCT3) codificados tumen le portador soluble 22 (SLC22) ch'i'ibalil (SLC22A1, SLC22A2 yéetel SLC22A3), le transportadores potenciales u MNA láayli' ma' táan definidos (28) . QPCR u mRNA u células T donantes saludables tu ye'esaj niveles expresión bajos u SLC22A1 Ba'ale' niveles indetectables u SLC22A2, ku confirmó u había sido ka'ache' informado ti' le literatura (yoochel 3F) (29). U jela'anil, le internet ichil celular tumoral ovárico SK-OV-3 expresó ka'anatako'ob niveles ti' le ka'ap'éel transportadores (yoochel 3F).
Utia'al u probar u posibilidad u células T yaantal le Buka'aj u ba'al u absorber MNA extranjero, células T donantes saludables bino'ob cultivadas ichil 72 horas tu taan jejeláas concentraciones MNA. Wa mina'an MNA exógeno, ma' tu páajtal u yila'al u contenido celular ti' MNA (yoochel 3G). Ba'ale', le células T activadas tratadas yéetel MNA exógeno mostraron jump'éel aumento dependiente ti' le dosis ti' le contenido MNA ti' le células, tak 6 mM MNA (yoochel 3G). Le ba'ala' ku ye'esik kex le t'okik nivel ti' expresión transportadora yéetel si'ipil le enzima noj bejo' responsable ti' le metabolismo MNA intracelular, TIL láayli' je'el u páajtal u ch'a'iko'ob MNA.
Le espectro metabolitos ti' le células T k'oja'ano'ob yéetel le experimentos absorción MNA in vitro aumentan le posibilidad ti' le fibroblastos asociados yéetel le k'ak'as k'oja'anil cáncer (CAF) secretan MNA yéetel le células tumorales páajtal regular le fenotipo yéetel le función TIL. Utia'al u yojéelta'al u efecto le MNA ti' le células T, le células T donantes saludables bino'ob activadas in vitro tu taan wa ausencia MNA, ka u proliferación yéetel producción citoquinas bino'ob evaluadas. Ka' 7 k'iino'ob u ts'áabal MNA ti' le dosis asab ka'anal, le meyaj ku duplicación le kaajnáalilo'obo' bin moderadamente reducido, ka' jo'op' u vigor bin mantenido ti' tuláakal le dosis (yoochel 4A). Beyxan, u ts'aak le MNA exógeno tu beetaj u ya'abtal u proporción le células T CD4 + yéetel CD8 + ku expresan factor necrosis tumoral-α (TNFα; yoochel 4B). U jela'anil, le producción intracelular ti' IFN-γ bin significativamente reducida ti' le células T CD4 +, ba'ale' ma' ti' le células T CD8 +, ka mina'an ka'ach mix k'eexpajal significativo ti' le interleucina 2 (IL-2; Figura 4, C yéetel D). Le o'olale', le ensayo inmunoabsorbente vinculado ti' le enzima (ELISA) ti' le sobrenadantes ti' le k'iino'oba' cultivos células T tratadas yéetel MNA tu ye'esaj jump'éel aumento significativo ti' TNFα, jump'éel disminución ti' IFN-γ, yéetel mix k'eexpajal ti' IL-2 (yoochel 4, E u G). . U yéemel IFN-γ ku ye'esik u MNA je'el u páajtal u báaxal jump'éel ju'un ti' le inhibición le actividad antitumoral ti' le células T. Utia'al u simular le efecto MNA ti' le citotoxicidad mediada tumen le células T, le células receptor antígeno quimérico T (FRα-CAR-T) dirigidas ti' le receptor folato α yéetel CAR-T (GFP) reguladas tumen le células proteína fluorescente ya'ax (GFP) -CAR-T) ku producidas tumen células mononucleares u k'i'ik'el periférica u donante saludable (PBMC). Le células CAR-T bino'ob cultivadas ichil 24 horas tu taan MNA, ka tu láak' co-cultivadas yéetel células tumorales ováricas SK-OV-3 humanas expresando receptor folato α ti' jump'éel relación efector u objetivo u 10:1. Ts'a'akal MNA resultó ti' jump'éel disminución significativa ti' le actividad kíinsa'al le células FRα-CAR-T, ba'ax ka'ach similar ti' le células FRα-CAR-T tratadas yéetel adenosina (yoochel 4H).
(A) Total recuento células viables yéetel duplicación le kaajnáalilo'obo' (PD) Jun ti' le miatsil ti' le k'iin 7. Le gráfico barras representa le promedio + SEM u seis donantes saludables. Ku chíikbesik datos ti' Ba'axten lo bey n = 3 experimentos independientes. (B u D) CD3 leti' CD28 yéetel IL-2 u utilizaron utia'al u activar le células T ti' u respectivas concentraciones MNA ichil 7 k'iino'ob. Táanil ti' u xak'alta'al, le células bino'ob estimuladas yéetel PMA leti' ionomicina yéetel GolgiStop ichil 4 horas. TNFα (B) expresión ti' células T. Ejemplo wíimbala' (ts'íik lela') yéetel datos tabulares (derecha) u expresión TNFα ti' células vivas. IFN-γ (C) yéetel IL-2 (D) expresión ti' células T. U ye'esajil le citoquinas bin u p'iss bey tumen citometría u flujo. Le gráfico ti' barras ku chíikbesik le promedio (n = 6 donantes saludables) + SEM. Meyaj análisis unidireccional ti' le varianza yéetel p'is kambalo'ob repetidas (*P<0.05 yéetel **P<0.01) utia'al u determinar le je'o' P. Ku chíikbesik datos ti' Ba'axten lo bey n = 3 experimentos independientes. (E u G) CD3 leti' CD28 yéetel IL-2 u utilizaron utia'al u activar le células T ti' u respectivas concentraciones MNA ichil 7 k'iino'ob. Le chúumuk bin recogido bey ma' yéetel ka' 4 horas u estimulación PMA leti' ionomicina. Le concentraciones TNFα (E), IFN-γ (F) yéetel IL-2 (G) bino'ob medidas tumen ELISA. Le gráfico ti' barras ku chíikbesik le promedio (n = 5 donantes saludables) + SEM. U tojol P determinado utilizando análisis unidireccional ti' le varianza yéetel mediciones repetidas (*P<0.05). Le internet ichil punteada indica le límite detección ti' le detección. (H) Ensayo u lisis celular. Le células FRα-CAR-T wa GFP-CAR-T bino'ob ajustadas yéetel adenosina (250μM) wa MNA (10 mM) ichil 24 horas, wa p'áatal ma' tratadas (Ctrl). P'iis u porcentaje u kíinsa'al le células SK-OV-3. P value determinado tumen Welch t test (*P<0.5 yéetel **P<0.01).
Utia'al u yantal jump'éel na'at mecanística ti' le regulación expresión TNFα dependiente ti' MNA, le cambios ti' TNFα mRNA ti' células T tratadas yéetel MNA bino'ob evaluados (yoochel 5A). Le células T donantes saludables tratadas yéetel MNA mostraron jump'éel aumento ka'ap'éel Óoxten ti' le niveles transcripción TNFα, indicando u MNA jach dependiente ti' le regulación transcripcional TNFα. Utia'al u xak'alta'al le mecanismo regulatorio je'ela', ka'ap'éel factores u transcripción k'ajóolta'ano'ob ku regulan TNFα, es decir factor nuclear u células T activadas (NFAT) yéetel proteína específica 1 (Sp1), bino'ob evaluados ti' núukik le unión MNA ti' le promotor TNFα proximal ( 30). Le promotor TNFα ku taasik 6 kúuchilo'ob unión NFAT identificados yéetel 2 kúuchilo'ob unión Sp1, ku superponen ti' jump'éel ts'ono'oto' [-55 pares k'oja'ano'obo' (bp) ti' le 5'cap] (30). Le inmunoprecipitación cromatina (ChIP) tu ye'esaj u ka u tratado yéetel MNA, le unión Sp1 ti' le promotor TNFα aumentó óoxp'éel Óoxten. U ts'áabal NFAT xan aumentó yéetel náats'al u k'a'ana'anil (yoochel 5B). Le k'iino'oba' datos indican u MNA regula le expresión TNFα yo'osal le transcripción Sp1, yéetel ti' jump'éel menor medida le expresión NFAT.
(A) Ti' comparación yéetel le células T cultivadas xma' MNA, le k'eexpajal doblez ti' le expresión TNFα ti' le células T tratadas yéetel MNA. Le patrón expresión yéetel SEM ku ye'esik (n = 5 donantes saludables). Ku chíikbesik datos ti' Ba'axten lo bey n = 3 experimentos independientes. (B) Le promotor TNFα ti' le células T tratadas yéetel wa xma' 8 mM MNA ka' NFAT yéetel Sp1 bino'ob combinados yéetel (Ctrl) yéetel estimulación PMA leti' ionomicina ichil 4 horas. Inmunoglobulina G (IgG) yéetel H3 u utilizaron bey kaambalilo'ob negativos yéetel positivos utia'al u inmunoprecipitación, respectivamente. Le cuantificación ChIP tu ye'esaj u le unión Sp1 yéetel NFAT ti' le promotor TNFα ti' células tratadas yéetel MNA aumentó ya'abkach Óoxten ti' comparación yéetel le kaambalil yo'osal. Ku chíikbesik datos ti' Ba'axten lo bey n = 3 experimentos independientes. P value determinado tumen ya'ab k'oja'ano'ob t-tests (*** P <0.01). (C) Ti' comparación yéetel le ascitis HGSC, células T (ma' citotóxicas) mostraron aumento ti' le expresión TNF ti' le tumor. Le boonilo'obo' ku chíikbesiko'ob jejeláas k'oja'ano'ob. Le células ku ye'esa'alo'obo' ts'o'ok u muestreado aleatoriamente u 300 yéetel jittered utia'al u limitar le sobredibujo (** Padj = 0.0076). (D) bix u propuesto u MNA utia'al u k'ak'as k'oja'anil cáncer u ovario. MNA ku beeta'al ti' células tumorales yéetel fibroblastos ti' TME yéetel ku ch'a'abal tumen células T. MNA ku ya'abtal u nupikubáa Sp1 ti' le promotor TNFα, ku bisik ti' jump'éel aumento ti' le transcripción TNFα yéetel le producción citoquinas TNFα. MNA xan ku beetik u yéemel IFN-γ. U jets'ik u meyaj le células T ku bisik u xu'ulul u páajtalil u kíinsa'al yéetel u séebtal u nojochtal le tumoro'.
Je'el bix u ya'alik le informe'obo', TNFα yaan ti' táanil yéetel táanil antitumoral yéetel antitumoral dependiente, ba'ale' yaan jump'éel ju'un k'ajóolta'an ti' le promoción tuméen yéetel metástasis le k'ak'as k'oja'anil cáncer u ovario (31-33). Je'el bix u ya'alik le informe'obo', u concentración TNFα ti' le ascitis yéetel le tejidos tumorales ti' le k'oja'ano'ob yéetel k'ak'as k'oja'anil cáncer u ovario asab ka'anal u le ti' le tejidos benignos (34-36). Tu yo'olal u mecanismo, TNFα je'el u páajtal u regular le activación, función yéetel proliferación glóbulos blancos, ka k'ex le fenotipo células cancerosas (37, 38). Je'el bix le ba'ax ku kaxta'ala', le análisis expresión genética diferencial tu ye'esaj u TNF bin significativamente up-regulated ti' le células T ti' le tejidos tumorales ti' comparación yéetel le ascitis (yoochel 5C). Le aumento ti' le expresión TNF chéen bin evidente ti' le poblaciones células T yéetel juntúul fenotipo ma' citotóxico (yoochel S5A). Ti' Resumen, le k'iino'oba' datos apoyan le visión u MNA yaan u ka'ap'éel táanil inmunosupresores yéetel promotores tumorales ti' HGSC.
Le etiquetado fluorescente basado ti' le citometría flujo u ts'o'ok convertido ti' le método noj bejo' utia'al u xook le metabolismo TIL. Le xooko'oba' ts'o'ok u demostrado u ti' comparación yéetel le linfocitos k'i'ik'el periférico wa células T u órganos linfoides p'iskaambal, TIL murino yéetel humano yaan jump'éel asab tendencia u absorción glucosa (4, 39) yéetel le asab gradual ti' le función mitocondrial (19, 40). Kex ts'o'ok k wilmaj ya'ala'al máaxo'ob máano'ob similares ti' le xooko', le ma'alo'ob clave jach u comparar le metabolismo células tumorales yéetel TIL ti' le k'iino' je'el xano' wa'ak'al tumoral resecado. Je'el bix u ya'alik yane' ti' le k'iino'oba' informes anteriores, le células tumorales (CD45-EpCAM +) ti' le ascitis yéetel le tumores yaan ti' asab absorción glucosa u CD8 + yéetel CD4 + células T, apoyando u le ka'anal absorción glucosa ti' le células tumorales je'el u páajtal u comparada yéetel le células T. U tuukulil u ketlamo'ob le células T. TME. Ba'ale', u meyaj le mitocondria ti' le células tumorales asab ka'anal ti' le u células CD8 + T, ba'ale' le actividad mitocondrial jach similar ti' le u células T CD4 +. Le ba'ax ku yila'ala' ku mu'uk'a'ankuunsik le chun tuukulo' ku jóok'ol ti' le metabolismo oxidativo jach k'a'anan uti'al u células tumorales (41, 42). Bey xan u ya'aliko'ob u le células T CD8 + páajtal u asab susceptibles ti' le disfunción oxidativa u le células T CD4 +, wa u le células T CD4 + páajtal utilizar fuentes carbono uláak' u glucosa utia'al u mantener le actividad mitocondrial (43, 44). K'a'ana'an u ya'ala'ale' ma' k ilik mix jump'éel jela'anil ichil u ch'a'abal glucosa wa u meyaj mitocondrial ichil le efectores CD4 + T, memoria efector T yéetel células memoria central T ti' le ascitis. Bey xan, le noj diferenciación CD8 + T células ti' le tumores mina'an mixba'al u yil yéetel cambios ti' le absorción glucosa, destacando u jela'anil in significativa ichil le células T cultivadas in vitro yéetel TIL humano in vivo (22). Le k'iino'oba' observaciones xan bino'ob confirmadas tumen u búukinta'al le asignación automática imparcial ti' le jo'olkaajo' celular, ku reveló asab táanil u CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + células yéetel asab absorción glucosa yéetel actividad mitocondrial u le células tumorales ku prevalentes Ba'ale' yaan u jo'olkaajo' celular activa metabólica. Le kaajo' je'el u páajtal u representar le subpoblación putativa u células supresoras mieloides wa células dendríticas plasmacitoides identificadas ti' le análisis scRNA-seq. Kex tu ka'atúulal le je'elo'oba' ts'o'ok u ya'ala'al ti' le tumores ováricos humanos [45], láayli' k'a'abéet u asab meyaj jach u describir le subpoblación mieloide.
Kex le métodos basados ​​ti' le citometría flujo páajtal aclarar le diferencias generales ti' le glucosa yéetel le metabolismo oxidativo ichil le tipos celulares, le metabolitos precisos producidos tumen le glucosa jump'éel uláak' fuentes carbono utia'al u metabolismo mitocondrial ti' TME láayli' ma' u séen determinado. U ts'aik u yaantal wa mina'an metabolitos ti' jump'éel subconjunto TIL k'a'abet u purificación le jo'olkaajo' celular ti' le wa'ak'al extirpado. Le o'olale', k método enriquecimiento celular combinado yéetel espectrometría ti' juuch' je'el u páajtal u ts'aik visión ti' le metabolitos ku enriquecen diferencialmente ti' células T yéetel poblaciones células tumorales ti' muestras k'oja'ano'ob coincidentes. Kex le método yaan ti' ventajas yóok'ol le clasificación células activadas tumen fluorescencia, ciertas bibliotecas metabolitos páajtal u afectadas debido a le estabilidad inherente yéetel leti' wa tasa rotación rápida (22). Kex beyo', k método bin capaz u identificar ka'ap'éel metabolitos inmunosupresores reconocidos, adenosina yéetel kynurenina, tuméen varían grandemente ichil tipos muestras.
K análisis metabonómico ti' le tumores yéetel le subtipos TIL proporciona asab visión yóok'ol le ju'uno' le metabolitos ti' le TME ovárico. Yáax, utilizando citometría flujo, determinamos u mina'an mix jela'anil in ti' le actividad mitocondrial ichil le tumores yéetel le células CD4 + T. Ba'ale', le análisis LC-MS leti' MS tu ye'esaj cambios significativos ti' le abundancia metabolitos ichil le k'iino'oba' poblaciones, indicando u conclusiones yóok'ol le metabolismo TIL yéetel u actividad metabólica global k'a'abet jump'éel interpretación cuidadosa. Tu ka' kúuchil, MNA leti' le metabolito yéetel le asab jela'anil in ichil le células CD45 yéetel le células T ti' le ascitis, ma' le tumores. Le o'olale', le compartimentación yéetel le tu'ux ku yaantal le tumor je'el u páajtal u yaantal jejeláas táanil ti' le metabolismo TIL, ku destaca le heterogeneidad páajtal ti' jump'éel microentorno dado. Tu yóoxp'éel kúuchil, u expresión le enzima productora u MNA NNMT u limita chuunil laat'a'an ti' CAF, ba'ax le células tumorales ti' jump'éel menor medida, ba'ale' niveles MNA detectables ku observan ti' células T derivadas ti' le tumor. Le sobreexpresión NNMT ti' le CAF ovárico yaan ti' jump'éel efecto k'ajóolta'an u promotor le k'ak'as k'oja'anil cáncer, tu parte debido a le promoción le metabolismo CAF, invasión tumoral yéetel metástasis (27). Kex le nivel global ti' TIL jach moderado, le expresión NNMT ti' CAF táan estrechamente relacionada yéetel le subtipo mesenquímico u Atlas u Genoma le k'ak'as k'oja'anil cáncer (TCGA), ku asocia yéetel k'aak'as pronóstico (27, 46, 47). Tu ts'ooke', u expresión le enzima AOX1 responsable ti' le degradación MNA xan u limita ti' le jo'olkaajo' CAF, ku indica u le células T carecen ti' le Buka'aj u ba'al u metabolizar MNA. Le ba'ax ku yila'ala' ku yáanta'al u tuukulil kex k'a'abéet u beeta'al uláak' meyaj uti'al u yila'al le ba'ala', ka'anatako'ob niveles MNA ti' células T je'el u páajtal u indicar u yaantal jump'éel microentorno CAF inmunosupresor.
Tuméen le t'okik nivel expresión ti' le transportadores MNA yéetel le niveles indetectables ti' proteínas clave involucradas ti' le metabolismo MNA, u yaantal MNA ti' le células T jach inesperada. Mix NNMT mix AOX1 je'el u páajtal u detectado tumen análisis scRNA-seq yéetel qPCR dirigido u ka'ap'éel cohortes independientes. Le ba'ax ku yila'ala' ku ye'esik u MNA ma' u sintetiza tumen células T, ba'ale' ku absorbe ti' le TME circundante. Le experimentos in vitro ku ye'esik u le células T tienden u acumular MNA exógeno.
K xook in vitro ts'o'ok u demostrado u MNA exógeno induce le expresión TNFα ti' células T yéetel mejora le unión Sp1 ti' le promotor TNFα. Kex TNFα yaan ti' noj antitumoral yéetel antitumoral, ti' le k'ak'as k'oja'anil cáncer u ovario, TNFα je'el u páajtal u promover tuméen le k'ak'as k'oja'anil cáncer u ovario (31-33). Le neutralización TNFα ti' le cultivos células tumorales ováricas wa le eliminación le señal TNFα ti' modelos ch'o' je'el u páajtal u ma'alo'obkíinsiko'ob u producción citoquinas inflamatorias mediadas tumen TNFα yéetel inhibir tuméen le tumor (32, 35). Le o'olale', te' óoltaj, MNA derivado u TME je'el u páajtal u actuar bey juntúul metabolito proinflamatorio yo'osal jump'éel mecanismo dependiente u TNFα yo'osal le lazo autocrino, promoviendo bey u aparición yéetel propagación le k'ak'as k'oja'anil cáncer u ovario (31). Yóok'ol le posibilidad, le bloqueo TNFα táan u xak'altik bey juntúul aj nu'uktaj terapéutico potencial utia'al u k'ak'as k'oja'anil cáncer u ovario (37, 48, 49). Beyxan, MNA ku k'askúuntik u citotoxicidad le células CAR-T ti' le células tumorales ováricas, proporcionando asab pruebas utia'al u supresión inmune mediada tumen MNA. Tu láakal, le k'iino'oba' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob sugieren jump'éel bix tu'ux le tumores yéetel le células CAF secretan MNA ti' TME extracelular. Yo'osal (i) estimulación tuméen le k'ak'as k'oja'anil cáncer u ovario inducida tumen TNF yéetel (ii) inhibición le actividad citotóxica u células T inducida tumen MNA, le je'ela' je'el u páajtal u yaantal jump'éel efecto tumoral dual (yoochel 5D).
Ti' conclusión, aplicando jump'éel combinación u enriquecimiento celular séeba'an, secuenciación u células únicas yéetel perfilado metabólico, le xooko' reveló le nukuch diferencias inmunometabolómicas ichil le tumores yéetel le células ascitis ti' le k'oja'ano'ob HGSC. Le análisis integral tu ye'esaj yaan diferencias ti' le absorción glucosa yéetel le actividad mitocondrial ichil le células T, ka identificó MNA bey juntúul metabolito regulador inmune autónomo ma' celular. Le k'iino'oba' datos yaan jump'éel impacto ti' bix TME afecta le metabolismo células T ti' le cánceres humanos. Kex ts'o'ok u ya'ala'al yaan u ketlamo'ob le nutrientes ichil le células T yéetel le células cancerosas, le metabolitos xan páajtal actuar bey reguladores indirectos utia'al u fomentar le progresión tumoral yéetel posiblemente suprimir le respuestas inmunes endógenas. U tsoolil u meyaj le metabolitos regulatorios je'el u páajtal u je'ek'abtik uláak' estrategias uti'al u ma'alo'obkíinsa'al le núukik inmune antitumoral.
Le muestras k'oja'ano'ob yéetel datos clínicos bino'ob obtenidos yo'osal le repositorio u wa'ak'al tumoral k'ak'as k'oja'anil cáncer BC certificado tumen le páawo'ob repositorio u wa'ak'al canadiense. Je'el bix u ya'alik le protocolo aprobado tumen le Comité Ética ti' Investigación ti' le K'ak'as k'oja'anil cáncer BC yéetel le Universidad u Columbia Británica (H07-00463), tuláakal le muestras k'oja'ano'ob yéetel datos clínicos obtuvieron consentimiento escrito informado wa formalmente renunciaron u consentimiento. Le muestras ku almacenan ti' le BioBank certificado (BRC-00290). U tsoolil le k'oja'ano'obo' ku ye'esik ti' le tablas S1 yéetel S5. Utia'al u criopreservación, ku meyajtiko'ob jump'éel bisturí utia'al u descomponer mecánicamente le muestra tumoral le k'oja'ano' ka tu láak' empujar ti' jump'éel filtro 100 micras utia'al u kéen p'áatak jump'éel suspensión chéen célula. U ascitis le k'oja'ano' bin centrifugado ti' 1500 rpm ichil 10 minutos ti' 4 ° c utia'al u pellet le células yéetel tselik le sobrenadante. Le células obtenidas ti' le tumor yéetel le ascitis bino'ob criopreservadas ti' 50% suero AB humano inactivado tumen ooxoj (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) yéetel 10% sulfóxido dimetilo. Le k'iino'oba' suspensiones u células únicas conservadas bino'ob descongeladas yéetel utilizadas utia'al u metabolómica yéetel determinación metabolitos descritos in continuación.
Le chúumuk completo consiste ti' 0.22 μm filtrado 50:50 complementado RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) complementado yéetel 10% suero AB humano inactivado tumen ooxoj (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific x1 Solución u penicilina estreptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) yéetel 50 μMB-mercaptoetanol. AimV (Invitrogen) ku ts'áabal yéetel 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) yéetel 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific). Le tampón u tinción le citómetro flujo consistía ti' 0.22μm fosfato filtrado tampón salina (PBS; Invitrogen) complementado yéetel 3 ti chúumuk suero humano AB inactivado tumen ooxoj (Sigma). Le tampón enriquecimiento celular u compuesto tumen 0.22μm PBS filtrado yéetel complementado yéetel 0.5% suero AB humano inactivado tumen ooxoj (Sigma-Aldrich).
Ti' 37°C chúumuk completo, le células bino'ob manchadas yéetel 10 nM MT DR yéetel 100 μM 2-NBDG ichil 30 minutos. Tu láak', le células bino'ob manchadas yéetel tinte viabilidad eF506 ti' 4 ° c ichil 15 minutos. Resuspender le células ti' FC Block (eBioscience) yéetel Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluir ti' flujo citometro tinción buffer (bin le t'aano'ob le fabricante), ka incubar ichil 10 minutos u temperatura ambiente. Mancha le células yéetel jump'éel tsol anticuerpos (tabla S2) ti' tampón tinción citometría flujo ti' 4 ° c ichil 20 minutos. Resuspender le células ti' tampón tinción citometría flujo (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) bey ma' u análisis. Meyaj SpectroFlo yéetel FlowJo V10 uti'al u xak'alta'al u datos u xookilo'ob células, yéetel meyaj GraphPad Prism 8 uti'al u beetik le datos. Le intensidad fluorescencia mediana (MFI) u 2-NBDG yéetel MT DR bin log-normalizada, ka tu láak' jump'éel prueba t emparejada bin utilizada utia'al u análisis estadístico utia'al u ts'aik yilaje' u k'oja'ano'ob emparejados. luk'es tuláakal le kaajo'ob yaan menos ti' 40 k'inbesajo'ob ti' le análisis; ts'íibt jump'éel je'o' MFI u 1 uti'al je'el ba'ax je'o' negativo bey ma' u beetik análisis estadístico yéetel visualización datos.
Utia'al u complementar le estrategia gating manual ti' le panel tuukula' anterior, utilizamos le anotación completa tumen le che'o' restricción beyo' (FAUST) (21) utia'al u asignar automáticamente células ti' le kaajnáalilo'obo' ka' eliminar células kimen ti' FlowJo. K gestionar manualmente le salida utia'al u fusionar poblaciones ku parecen u mal asignadas (combinando PD1 + yéetel células tumorales PD1) yéetel poblaciones retenidas. Amal muestra ku taasik jump'éel promedio asab ti' 2% células, uti'al jump'éel total u 11 poblaciones.
U centrifugación u densidad gradiente Ficoll u utilizado utia'al u separar PBMC u yik'áalil separación leucocitos (STEMCELL Technologies). Le células CD8 + T bino'ob aisladas ti' PBMC utilizando CD8 MicroBeads (Miltenyi) yéetel expandidas ti' chúumuk completo utilizando TransAct (Miltenyi) ichil 2 semanas bin le t'aano'ob le fabricante. Le células bino'ob permitidas u wa'atal ichil 5 k'iino'ob ti' chúumuk completo ku taasik IL-7 (10 ng leti' ml; PeproTech), ka tu láak' re-estimulados yéetel TransAct. Tu k'iinil 7, je'el bix u ya'alik le fabricanteo', u utilizaron CD45 MicroBeads humanos (Miltenyi) utia'al u enriquecer le células ti' óoxp'éel rondas consecutivas. Le células bino'ob alicuotadas utia'al u análisis citometría flujo (bey descrito ka'anal), ka jump'éel millón células bino'ob alicuotadas óoxp'éel Óoxten utia'al u análisis LC-MS leti' MS. Le muestras bino'ob procesadas tumen LC-MS leti' MS bey descrito in continuación. K estimamos le je'o' metabolito sa'atal yéetel juntúul meyaj ku iones 1.000. Amal muestra ku normaliza tumen le meyaj ku iones total (TIC), logarítmicamente convertido yéetel automáticamente normalizado ti' MetaboAnalystR bey ma' u análisis.
Le suspensión chen célula ti' Amal k'oja'ano' bin descongelada yéetel filtrada tumen juntúul filtro 40 μm ti' chúumuk completo (bey descrito ka'anal). Bin u protocolo le fabricante, óoxp'éel rondas consecutivas u selección positiva tumen separación magnética u perlas utilizando MicroBeads (Miltenyi) u utilizaron utia'al u enriquecer le muestras utia'al u CD8 +, CD4 + yéetel CD45- células (ti' hielo). Tu ke, le células ku resuspenden ti' tampón enriquecimiento celular (bey descrito ka'anal) yéetel contados. Le células bino'ob incubadas yéetel perlas CD8 humanas, perlas CD4 humanas wa perlas CD45 humanas (Miltenyi) ti' 4 ° C ichil 15 minutos, ka tu láak' lavadas yéetel tampón enriquecimiento celular. Le muestra ku máan tumen le columna LS (Miltenyi), yéetel le fracciones positivas yéetel negativas ku recogen. Utia'al u xu'ulul u k'iinil yéetel u maximizar le paso recuperación celular, le CD8-fracción ku meyajtiko'ob túun utia'al u segunda ronda u enriquecimiento CD4 +, yéetel le CD4-fracción ku meyajtiko'ob utia'al u posterior CD45-enriquecimiento. P'atik le solución yóok'ol hielo ichil tuláakal le tuukula' separación.
Utia'al u preparar le muestras utia'al u análisis metabolitos, le células bino'ob lavadas juntéene' yéetel solución ta'ab síis bey hielo, ka 1 ml u 80 ti chúumuk metanol bin u añadido ti' Amal muestra, ts'o'okole' vortexed yéetel snap congelado ti' nitrógeno líquido. Le muestras bino'ob sometidas ti' óoxp'éel ciclos congelación-descongelación yéetel centrifugadas ti' 14.000 rpm ichil 15 minutos ti' 4 ° c. Le sobrenadante ku taasik le metabolitos ku evapora tak ka tikin. Le metabolitos bino'ob u ka'a disueltos ti' 50 μl u 0.03% ácido fórmico, vortexed utia'al u xa'ak'tik, ka tu láak' centrifugado utia'al u luk'ul Teeche' le escombros.
jóok'es le metabolitos je'el bix u ya'alik ka'anal. Transferir le sobrenadante ti' jump'éel botella cromatografía líquida u ka'anal rendimiento uti'al u investigación metabolómica. Meyaj juntúul protocolo u Ts'a'akal aleatorio utia'al u k'aax Amal muestra yéetel juntúul meyaj ku similar u células utia'al Jech táanil tumen lotes. K meentik jump'éel p'is kambalo' cualitativo ti' le metabolitos globales publicados ka'ache' ti' le AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Análisis cromatográfico yéetel integración yo'osal u pico u realizaron utilizando software MultiQuant versión 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Utilizó jump'éel recuento iones 1000 utia'al u estimar le je'o' metabolito sa'atal, ka le TIC Amal muestra u utilizado utia'al u calcular le yo'osal u pico normalizado u Amal metabolito detectado utia'al u corregir le cambios introducidos tumen le análisis instrumental u procesamiento le muestra. Le ken ts'o'okok u normalizar u TIC, MetaboAnalystR (51) (parámetro tumen defecto) ku meyajtiko'ob utia'al u yokol k'ujo'ob logarítmica yéetel escala automática u internet ichil norma. Utilizamos PCA yéetel paquete R vegano utia'al u meentik análisis exploratorio ti' le diferencias metaboloma ichil tipos muestras, ka utilizamos análisis redundancia parcial utia'al u analizar k'oja'ano'ob. Meyaj método Ward utia'al u construir jump'éel dendrograma mapa ooxoj utia'al u agrupar le distancia euclidiana ichil le muestras. Meyajnajto'on limma (52) ti' le abundancia metabolitos estandarizadas utia'al u identificar metabolitos diferencialmente abundantes ti' tuláakal le bin yano'ob célula yéetel le microentorno. Utia'al u simplificar le tsoolil, utilizamos le parámetro promedio múuch' utia'al especificar le bix, ka considerar le tipos celulares ti' le microentorno bey Amal múuch' (n = 6 múuch'); uti'al u pruebail u k'a'ana'anil, k meentik óoxp'éel mediciones repetidas uti'al Amal metabolito Utia'al Jech u falsa replicación, le k'oja'ano' bin incluido bey jump'éel obstáculo ti' le diseño limma. Utia'al u yila'al u jela'anil le metabolitos ichil jejeláas k'oja'ano'obo', ajustamos le bix limma incluyendo k'oja'ano'ob ti' jump'éel bix ken fija. K ts'áaik ojéeltbil u k'a'ana'anil le contraste preespecificado ichil le bin yano'ob célula yéetel le microentorno u Padj <0.05 (corrección Benjamini-Hochberg).
Ka' u enriquecimiento le vigor utilizando Miltenyi Dead Cell Removal Kit (> 80% viabilidad), u secuenciación le transcriptoma u chéen célula u realizó ti' le muestras ascitis congeladas yéetel tumores totales ti' vivo utilizando jump'éel protocolo expresión 10 x 5′gen. Kanp'éel casos yéetel tumores coincidentes yéetel ascitis bino'ob analizados, kex le baja viabilidad jump'éel muestra tumoral impidió u inclusión. Utia'al u kaxta'al u yúuchul ya'abkach selecciones k'oja'ano'ob, combinamos le muestras Amal k'oja'ano' ti' le carriles le controlador cromo 10 x, ka analizamos le ascitis yéetel le kúuchilo'ob tumorales tumen separado. Ka' u secuenciación [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genoma Quebec; jump'éel promedio 73.488 yéetel 41.378 xook tumen célula utia'al u tumor yéetel ascitis respectivamente]], utilizamos CellSNP yéetel Vireo (53) (basado ti' CellSNP bey Le SNP humano común (VCF) proporcionado tumen GRCh38 ku asigna jump'éel identidad donante. Utilizamos SNPRelate utia'al u inferir le identidad asab cercana (IBS) ti' le genotipo k'oja'ano'ob (IBS) excluyendo células ma' asignadas yéetel células identificadas bey dúplex yéetel donantes coincidentes ichil le muestras ascites yéetel tumorales (54). (2792 yéetel 4183 células u tumor yéetel ascite, respectivamente) utia'al u análisis utilizamos agrupación u igraph (57) Louvain u páawo'ob vecino asab cercano compartido (SNN) basado ti' le distancia Jaccard ti' le células clúster tumen expresión Le agrupaciones bino'ob anotadas manualmente ti' tipos celulares putativos basados ​​ti' le expresión genética tóxica TNE le células ku definen tumen le expresión CD8A yéetel GZMA, excluyendo subgrupos yéetel baja expresión proteína ribosomal.
PBMC bino'ob separados ti' le yik'áalil separación leucocitos (STEMCELL Technologies) tumen centrifugación densidad gradiente Ficoll. Le células CD3 + bino'ob aisladas ti' PBMC utilizando cuentas CD3 (Miltenyi). Wa yaan wa mina'an MNA, le células CD3+ bino'ob activadas yéetel CD3 unido ti' placa (5μg leti' ml), CD28 soluble (3μg leti' ml) yéetel IL-2 (300 U leti' ml; Proleucina). Tu ts'ook k'iinil u expansión, le viabilidad (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) yéetel le proliferación (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) bino'ob evaluados tumen citometría flujo. Evaluar le función efector tumen estimular le células yéetel PMA (20 ng leti' ml) yéetel ionomicina (1μg leti' ml) yéetel GolgiStop ichil 4 horas, ka monitorear CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) yéetel TNFα-fluoresceinsothianato (TCFI1b), 1 BD). Estimular le células qPCR yéetel ChIP yéetel PMA (20 ng leti' ml) yéetel ionomicina (1μg leti' ml) ichil 4 horas. Le sobrenadante ELISA bin u recogido bey ma' yéetel ka' estimulación yéetel PMA (20 ng leti' ml) yéetel ionomicina (1 μg leti' ml) ichil 4 horas.
Bin le protocolo le fabricante utia'al u aislar le ARN utilizando RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Meyaj QIAshredder (QIAGEN) uti'al u homogeneizar le muestra. Meyaj kit RNA ti' cDNA ka'anal Buka'aj u ba'al (Thermo Fisher Scientific) uti'al u sintetizar ADN complementario (cDNA). Meyaj TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) uti'al u p'iis le expresión genética (bin u protocolo le fabricante) yéetel le je'ela' sondas: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042755515S, 12 Hs02786624_g1 [gliceraldehído-3-fosfato paach hidrógeno (GAPDH)] yéetel Hs01010726_m1 (SLC22A2). Le muestras bino'ob ejecutadas ti' le yaan PCR tu k'iinil xíimbal tumen StepOnePlus (Biosistemas aplicados) (Biosistemas aplicados) ti' le placa reacción óptica rápida 96-well MicroAmp (Biosistemas aplicados) yéetel cha'ano' óptica MicroAmp. Je'el ba'alak je'el Ct ku máan ti' 35 ku yila'al yaan por encima de le umbral detección yéetel ku marca bey ma' detectable.
Meentik ChIP je'el bix ts'o'ok u ya'ala'al ka'ache' (58). Tu ts'ooke', le células bino'ob tratadas yéetel formaldehído (concentración final 1.42%) yéetel incubadas u temperatura ambiente ichil 10 minutos. Meyaj tampón hinchazón suplementado (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl yéetel 0.1% NP-40) yóok'ol hielo ichil 10 minutos, ts'o'okole' resuspender ti' tampón inmunoprecipitación bey descrito (58 ). Le muestra bin túun sonicada yéetel le je'ela' ciclos: 10 ciclos (20 pulsos 1-segundo) yéetel jump'éel k'iin estático u 40 segundos. Incubar ChIP-grado inmunoglobulina G (Ma'alo'obtal u señalización celular; 1μl), histona H3 (Ma'alo'obtal u señalización celular; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) yéetel SP1 (Ma'alo'obtal u señalización celular; 3μl) anticuerpos yéetel le muestra ti' 4 ° CC sacudida ichil áak'ab. Incuba le perlas proteína A (Thermo Fisher Scientific) yéetel le muestra ti' 4 ° C yéetel O'olkij agitación ichil 1 p'isib, ts'o'okole' meyaj perlas chelex (Bio-Rad) utia'al u enriquecer le ADN, ka meyaj proteinasa K (Thermo Fisher) utia'al u digestión le proteína. TNFα promotor bin detectado tumen PCR: táanil, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; tu contrario, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp producto). Le oochelo'obo' bino'ob producidas tumen Image Lab (Bio-Rad) yéetel cuantificadas utilizando software ImageJ.
Le sobrenadante cultivos celular bin u recogido bey descrito ka'anal. Le determinación bin u bisik ka'ansaj bin le procedimientos le fabricante ti' le kit ELISA TNFα humano (Invitrogen), kit ELISA IL-2 humano (Invitrogen) yéetel kit ELISA IFN-γ humano (Abcam). Bin u protocolo le fabricante, le sobrenadante bin diluido 1:100 utia'al u detectar TNFα yéetel IL-2, yéetel 1:3 utia'al u detectar IFN-γ. Meyaj EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) uti'al u p'iis le absorción ti' 450 nm.
PBMC bino'ob separados ti' le yik'áalil separación leucocitos (STEMCELL Technologies) tumen centrifugación densidad gradiente Ficoll. Le células CD3 + bino'ob aisladas ti' PBMC utilizando cuentas CD3 (Miltenyi). Wa yaan wa mina'an MNA, le células CD3+ bino'ob activadas yéetel CD3 unido ti' placa (5μg leti' ml), CD28 soluble (3μg leti' ml) yéetel IL-2 (300 U leti' ml; Proleucina) ichil 3 k'iino'ob. Ka' 3 k'iino'ob, le células bino'ob recogidas yéetel lavadas yéetel 0.9% solución salina, ka le pelotilla bin u congelada. U xookil le células beeta'ab yéetel citometría de flujo (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) utilizando 123count eBeads.
jóok'es le metabolitos je'el bix u ya'alik ka'anal. Le extracto seco bin u reconstituido ti' jump'éel concentración 4000 equivalentes células leti' μl. Analizar le muestra tumen cromatografía fase inversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) yéetel columna CORTECS T3 (2.1×150 mm, Buka'aj partícula 1.6-μm, Buka'aj poro 120-Å; #186008500, Ja'ilo'ob). Espectrómetro de masas polares (6470, Agilent), tu'ux ku meyaj le ionización electrospray ti' modo positivo. Le fase móvil A jach 0.1% ácido fórmico (ti' H2O), fase móvil B jach 90% acetonitrilo, 0.1% ácido fórmico. Le gradiente LC jach 0 u 2 minutos utia'al u 100 ti chúumuk A, 2 u 7.1 minutos utia'al u 99 ti chúumuk B, yéetel 7.1 u 8 minutos utia'al u 99 ti chúumuk B. Tu láak' k'a' equilibrar le columna yéetel fase móvil A ti' jump'éel caudal 0.6 ml leti' min ichil 3 minutos. . Le velocidad flujo jach 0.4ml leti' min, yéetel le cámara columna ku calenta u 50 ° c. Meyaj le estándar químico puro u MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) utia'al u establecer k'iinil retención (RT) yéetel transformación (RT = 0.882 minutos, transformación 1 = 137→94.1, transformación 2 = 137→92 , Conversión = 13→77). Le ken u yúuchul tuláakal le óoxp'éel transiciones ti' le k'iin retención correcta, le transición 1 ku meyajtiko'ob utia'al u cuantificación utia'al u asegurar le especificidad. Le curva estándar ti' MNA (Toronto Research Chemical Company) bin generada tumen seis diluciones serie ti' le solución stock (1 mg leti' ml) utia'al u kéen p'áatak estándares 0.1, 1.0, 10 yéetel 100 ng leti' ml yéetel 1.0 yéetel 10μg leti' ml respectivamente líquido. Le límite detección jach 1 ng leti' ml, yéetel le núukik lineal jach ichil 10 ng leti' ml yéetel 10μg leti' ml. Amal inyección ka'ap'éel microlitros u muestra yéetel estándar ku meyajtiko'ob utia'al u análisis LC leti' MS, ka jump'éel muestra kaambalil yo'osal calidad mixta ku ejecuta Amal waxak inyecciones utia'al u asegurar le estabilidad le plataforma análisis. Le respuestas MNA ti' tuláakal le muestras celulares tratadas yéetel MNA bino'ob ichil le rango lineal ti' le ensayo. U xak'alil le datoso'obo' beeta'ab yéetel u software u xak'alil u xookil MassHunter (v9.0, Agilent).
Le segunda generación αFR-CAR construcción bin u ch'a'abal u Song et el. (59). Tu ke, le construcción ku taasik le je'ela' contenidos: secuencia líder CD8a, fragmento variable u tsolokbal única específica u αFR humano, bisagra CD8a yéetel región transmembrana, dominio intracelular CD27 yéetel dominio intracelular CD3z. Le secuencia CAR completa bin sintetizada tumen GenScript, ka tu láak' clonada ti' le vector expresión lentiviral u segunda generación yuk'ul le casete expresión GFP utilizada utia'al u evaluar le eficiencia transducción.
Le lentivirus ku beeta'al tumen transfección u células HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); pak'a'an ti' chúumuk Eagle modificado u Dulbecco ku taasik 10% suero bovino fetal (FBS) yéetel 1% PenStrep, ka utilizado vector CAR-GFP yéetel Le plásmidos embalaje (psPAX2 yéetel pMD2.G, Addgene) utilizan amina lipofección (Sigma-Aldrich). Le sobrenadante ku taasik viruso' bin u much'ik 48 yéetel 72 horas ka' u transfección, filtrado yéetel concentrado tumen ultracentrifugación. Almacenar le sobrenadante viral concentrado ti' -80 ° c tak ka transducción.
PBMC ku separados ti' le yik'áalil separación leucocitos donantes saludables (STEMCELL Technologies) tumen centrifugación densidad gradiente Ficoll. Meyaj microperlas CD8 selección positiva (Miltenyi) utia'al u aislar células CD8 + u PBMC. Estimular le células T yéetel TransAct (Miltenyi) yéetel ti' chúumuk TexMACS [Miltenyi; ts'a'abal yéetel 3% suero humano inactivado tumen ooxoj, 1% PenStrep yéetel IL-2 (300 U/ml)]. Veinticuatro horas ka' u estimulación, le células T bino'ob transducidas yéetel lentivirus (10 μl sobrenadante virus concentrado tumen 106 células). 1 u 3 k'iino'ob ka' u transducción ti' Cytek Aurora (ti' FSC (Forward Scatter) leti' SSC (Side Scatter), Singlet, GFP +), evaluar le expresión GFP ti' le células utia'al u demostrar jump'éel eficiencia transducción Ba'axten lo bey 30% .
Le células CAR-T bino'ob cultivadas ichil 24 horas ti' Immunocult (STEMCELL Technologies; complementado yéetel 1% PenStrep) yáanal le je'ela' condiciones: ma' tratadas, tratadas yéetel 250 μM adenosina wa 10 mM MNA. Ka' ts'o'ok u pretratamiento, le células CAR-T bino'ob lavadas yéetel PBS yéetel combinadas yéetel 20.000 células SK-OV-3 [ATCC; ti' McCoy 5A chúumuk (Sigma-Aldrich) complementado yéetel 10 ti chúumuk FBS yéetel 1 ti chúumuk PenStrep ti' 10: Le relación efector ti' objetivo u 1 bin amplificada ti' triplicado ti' chúumuk Immunocult complementado. Le células SK-OV-3 yéetel le células SK-OV-3 lisadas yéetel saponina digitalis (0.5mg leti' ml; Sigma-Aldrich) u utilizaron bey kaambalilo'ob negativos yéetel positivos, respectivamente. Ka' 24 horas u co-cultivo, le sobrenadante bin u recogido yéetel le lactato deshidrogenasa (LDH) bin u P'iis bin le t'aano'ob le fabricante (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Le sobrenadante LDH bin diluido 1:50 ti' tampón LDH. Le porcentaje kíinsa'ab tu táan le fórmula je'ela': porcentaje kíinsa'al = porcentaje corrección / tasa máxima u kíinsa'al x 100%, tu'ux porcentaje corrección = co-cultivo-T células chéen, yéetel tasa máxima kíinsa'al = kaambalil yo'osal positivo-kaambalil yo'osal negativo.
Je'el bix u ya'alik le analte'o' wa le materiales yéetel le métodos, meyaj GraphPad Prism 8, Microsoft Excel wa R v3.6.0 uti'al u análisis estadístico. Wa ku ch'a'abal ya'abkach muestras ti' le k'oja'ano' (bey le ascitis yéetel le tumor), utilizamos jump'éel prueba t emparejada wa incluimos le k'oja'ano' bey jump'éel efecto aleatorio ti' jump'éel bix lineal wa generalizado bin apropiado. Utia'al u análisis metabolómico, le prueba importancia ku beeta'al ti' triplicado.
Utia'al u láak' ba'alo'ob uti'al le artículoa', wil http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Lela' jump'éel artículo u muuk' abierto distribuido yáanal le términos le licencia Creative Commons Attribution-Non-Commercial, ku cha'antik u búukinta'al, distribución yéetel reproducción ti' je'el ba'ax medios, siempre yéetel ken u búukinta'al final ma' u utia'al u ganancia comercial yéetel le premisa jach u le meyajo' áantajil jach correcto. Reeferensia.
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R.R. Bellnis), Deraphnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA ku yáantaj ti' le supresión inmune ti' le células T yéetel representa jump'éel potencial objetivo inmunoterapia utia'al u Ts'a'akal le k'ak'as k'oja'anil cáncer humano.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R.R. Bellnis), Deraphnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA ku yáantaj ti' le supresión inmune ti' le células T yéetel representa jump'éel potencial objetivo inmunoterapia utia'al u Ts'a'akal le k'ak'as k'oja'anil cáncer humano.
©2021 Asociación Americana utia'al u táanil le ciencia. tuláakal u páajtalilo'ob. AAAS leti' jump'éel socio ti' HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef yéetel COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.